Schimbul hidrogen-deuteriu a fost măsurat inițial de părintele schimbului de hidrogen, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, folosind tuburi cu gradient de densitate. În epoca modernă, schimbul H-D a fost monitorizat în principal prin metodele: Spectroscopia RMN, spectrometria de masă și cristalografia neutronică. Fiecare dintre aceste metode are avantajele și dezavantajele sale.
Spectroscopia RMNEdit
Nucleele de hidrogen și deuteriu sunt extrem de diferite în ceea ce privește proprietățile lor magnetice. Astfel, este posibil să se facă distincția între ele prin spectroscopie RMN. Deuteronii nu vor fi observați într-un spectru RMN 1H și, invers, protonii nu vor fi observați într-un spectru RMN 2H. În cazul în care se observă semnale mici într-un spectru RMN 1H al unei probe puternic deuterate, acestea sunt denumite semnale reziduale. Acestea pot fi utilizate pentru a calcula nivelul de deuterației într-o moleculă. Semnale analoge nu se observă în spectrele RMN 2H din cauza sensibilității scăzute a acestei tehnici în comparație cu analiza 1H. Deuteronii prezintă, de obicei, deplasări chimice foarte asemănătoare cu protonii lor analogi. Analiza prin spectroscopia 13C RMN este, de asemenea, posibilă: valorile diferite de spin ale hidrogenului (1/2) și deuteriului (1) dau naștere la multiplicități de divizare diferite. Spectroscopia RMN poate fi utilizată pentru a determina deuterația specifică locului moleculelor.
O altă metodă utilizează spectrele HSQC. În mod obișnuit, spectrele HSQC sunt înregistrate la o serie de momente de timp în timp ce hidrogenul face schimb cu deuteriul. Deoarece experimentul HSQC este specific pentru hidrogen, semnalul va scădea exponențial pe măsură ce hidrogenul se schimbă. În acest caz, este posibil să se adapteze o funcție exponențială la date și să se obțină constanta de schimb. Această metodă oferă informații specifice reziduurilor pentru toate reziduurile din proteină în mod simultan Dezavantajul major este că necesită o atribuire prealabilă a spectrului pentru proteina în cauză. Acest lucru poate necesita foarte multă muncă și, de obicei, limitează metoda la proteine mai mici de 25 kDa. Deoarece înregistrarea unui spectru HSQC durează de la câteva minute până la câteva ore, amidele care se schimbă rapid trebuie măsurate folosind alte secvențe de impulsuri.
Spectrometrie de masăEdit
Spectrometria de masă cu schimb de hidrogen-deuteriu poate determina conținutul global de deuteriu al moleculelor care au suferit un schimb H/D. Din cauza pregătirii probei necesare, se consideră, de obicei, că oferă o măsurare precisă numai a atomilor de hidrogen care nu pot fi schimbați. Aceasta poate implica, de asemenea, schimbul H/D în faza gazoasă sau schimbul în faza de soluție înainte de ionizare. Are mai multe avantaje în spectroscopia RMN în ceea ce privește analiza reacțiilor de schimb H/D: este nevoie de mult mai puțin material, concentrația probei poate fi foarte mică (până la 0,1 uM), limita de mărime este mult mai mare, iar datele pot fi, de obicei, colectate și interpretate mult mai rapid.
Nucleul de deuteriu este de două ori mai greu decât nucleul de hidrogen, deoarece conține un neutron, precum și un proton. Astfel, o moleculă care conține puțin deuteriu va fi mai grea decât una care conține numai hidrogen. Pe măsură ce o proteină este din ce în ce mai deuterată, masa moleculară crește în mod corespunzător. Detectarea modificării masei unei proteine în urma deuterației a fost posibilă prin spectrometria de masă modernă a proteinelor, raportată pentru prima dată în 1991 de Katta și Chait.
Determinarea deuterației specifice unui situs prin spectrometrie de masă este mai complicată decât utilizarea spectroscopiei RMN. De exemplu, localizarea și cantitatea relativă de schimb de deuteriu de-a lungul coloanei vertebrale peptidice pot fi determinate aproximativ prin supunerea proteinei la proteoliză după ce reacția de schimb a fost stinsă. Peptidele individuale sunt apoi analizate pentru deuterarea globală a fiecărui fragment peptidic. Cu ajutorul acestei tehnici, rezoluția schimbului de deuteriu este determinată de dimensiunea peptidelor produse în timpul digestiei. Pepsina, o protează acidă, este utilizată în mod obișnuit pentru proteoliză, deoarece pH-ul de stingere trebuie menținut în timpul reacției proteolitice. Pentru a reduce la minimum schimbul invers, proteoliza și analiza ulterioară prin spectrometrie de masă trebuie să se facă cât mai repede posibil. Separarea HPLC a digestului peptic este adesea efectuată la temperatură scăzută chiar înainte de spectrometria de masă prin electrospray pentru a minimiza schimbul de reacție. Mai recent, a fost utilizată UPLC datorită capacităților sale superioare de separare.
În 1999 s-a propus că ar putea fi posibilă obținerea unei rezoluții cu un singur reziduu prin utilizarea fragmentării prin disociere indusă de coliziune (CID) a peptidelor deuterate în combinație cu spectrometria de masă în tandem. La scurt timp s-a descoperit că CID provoacă „amestecarea” poziției de deuteriu în cadrul peptidelor. Cu toate acestea, fragmentarea produsă de MALDI prin dezintegrare în sursă (ISD), disocierea prin captare de electroni (ECD) și disocierea prin transfer de electroni (ETD) se desfășoară cu foarte puțină sau chiar fără bruiaj în condiții experimentale corecte. Amestecarea etichetării izotopice este cauzată de încălzirea prin coliziune înainte de disocierea ionului și, în timp ce CID cauzează amestecul, încălzirea prin coliziune poate avea loc, de asemenea, în timpul ionizării și transportului ionilor. Cu toate acestea, prin optimizarea atentă a parametrilor instrumentului care cauzează încălzirea ionilor, se poate minimiza bruiajul hidrogenului până la un grad care să păstreze marcarea izotopică în fază de soluție până când fragmentarea poate fi efectuată cu ajutorul unei tehnici în care nu se produce bruiajul. Mai recent, fotodisocierea în ultraviolete (UVPD) a fost, de asemenea, investigată ca o posibilă tehnică de fragmentare pentru a localiza deuteriul în cadrul peptidelor și proteinelor. În această privință, concluziile au fost amestecate, în timp ce este posibil să se obțină fragmente UVPD care nu a suferit o bruiere în anumite condiții, altele au arătat că se poate produce o bruiere atât pentru peptide, cât și pentru proteine în timpul etapei de fragmentare UVPD în sine. Teoria actuală care consolidează aceste contradicții aparente are legătură cu calea dublă de fragmentare care poate apărea în urma iradierii UV a peptidelor și proteinelor, și anume disocierea directă și statistică. Adică, dacă condițiile experimentale favorizează disocierea directă și dacă ionul precursor este menținut la energii interne scăzute înainte și în timpul fragmentării, nivelul de deuteriu al fragmentelor rezultate va corespunde precursorului neîmpărțit. Cu toate acestea, condițiile experimentale pot favoriza disocierea statistică în timpul iradierii cu UV, în special la timpi lungi de iradiere și la o presiune scăzută a gazului, ceea ce duce la conversia internă a energiei de excitație electronică la care contribuie fotonii UV. Rezultatul este o excitație vibrațională a moleculei iradiate care, la rândul ei, suferă o dezordine.
Cristalografie neutronicăEdit
Schimbul hidrogen-deuteriu al speciilor cu schimb rapid (de exemplu, grupările hidroxil) poate fi măsurat cantitativ la rezoluție atomică prin cristalografie neutronică, și în timp real dacă schimbul este efectuat în timpul experimentului de difracție.
Fereștile de neutroni de intensitate mare sunt în general generate prin spallație la acceleratoare de particule linac, cum ar fi Sursa de neutroni de spallație. Neutronii difractă cristalele în mod similar cu razele X și pot fi utilizați pentru determinarea structurală. Atomii de hidrogen, care au între unu și zero electroni în mediul biologic, difractă slab razele X și sunt efectiv invizibili în condiții experimentale normale. Neutronii se împrăștie din nucleele atomice și, prin urmare, sunt capabili să detecteze atomii de hidrogen și deuteriu.
Atomii de hidrogen sunt înlocuiți în mod obișnuit cu deuteriu, care introduc un factor de împrăștiere puternic și pozitiv. Adesea este suficient să se înlocuiască doar atomii de hidrogen labili și solvenți într-un cristal de proteină prin difuzie de vapori. Într-o astfel de structură, gradul de ocupare a unui atom de deuteriu schimbabil într-un cristal se va rafina de la 0-100%, cuantificând în mod direct cantitatea de schimb.
.