Spectrometrie de masă în tandem

Fragmentarea ionilor în fază gazoasă este esențială pentru spectrometria de masă în tandem și are loc între diferite etape ale analizei de masă. Există mai multe metode utilizate pentru fragmentarea ionilor și acestea pot avea ca rezultat diferite tipuri de fragmentare și, astfel, diferite informații despre structura și compoziția moleculei.

Fragmentare în sursăEdit

De multe ori, procesul de ionizare este suficient de violent pentru a lăsa ionii rezultați cu suficientă energie internă pentru a se fragmenta în cadrul spectrometrului de masă. În cazul în care ionii produși persistă în starea lor de neechilibru pentru o perioadă moderată de timp înainte de autodisociere, acest proces se numește fragmentare metastabilă. Fragmentarea de tip „nozzle-skimmer” se referă la inducerea intenționată a fragmentării în sursă prin creșterea potențialului nozzle-skimmer la instrumentele bazate de obicei pe electrospray. Deși fragmentarea în sursă permite analiza fragmentară, aceasta nu este, din punct de vedere tehnic, o spectrometrie de masă în tandem decât dacă ionii metastabili sunt analizați în masă sau selectați înainte de autodisociere și dacă se efectuează o a doua etapă de analiză a fragmentelor rezultate. Fragmentarea în sursă poate fi utilizată în locul spectrometriei de masă în tandem prin utilizarea tehnologiei EISA (Enhanced in-Source Fragmentation Annotation), care generează o fragmentare care se potrivește direct cu datele spectrometriei de masă în tandem. Fragmentele observate prin EISA au o intensitate a semnalului mai mare decât fragmentele tradiționale care suferă pierderi în celulele de coliziune ale spectrometrelor de masă în tandem. EISA permite achiziționarea de date de fragmentare pe analizoare de masă MS1, cum ar fi instrumentele cu timp de zbor și cele cu un singur cuadripol. Fragmentarea în sursă este adesea utilizată în plus față de spectrometria de masă în tandem (cu fragmentare post-sursă) pentru a permite două etape de fragmentare într-un experiment de tip pseudo MS3.

Disocierea indusă de coliziuneEdit

Fragmentarea post-sursă este cel mai adesea ceea ce se utilizează într-un experiment de spectrometrie de masă în tandem. De asemenea, se poate adăuga energie la ioni, care de obicei sunt deja excitați vibrațional, prin coliziuni post-sursă cu atomi sau molecule neutre, prin absorbția de radiații sau prin transferul sau captarea unui electron de către un ion cu sarcină multiplă. Disocierea indusă prin coliziune (CID), denumită și disociere activată prin coliziune (CAD), presupune coliziunea unui ion cu un atom sau o moleculă neutră în faza gazoasă și disocierea ulterioară a ionului. De exemplu, considerăm

AB + + M ⟶ A + B + + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}.

în care ionul AB+ se ciocnește cu specia neutră M și ulterior se descompune. Detaliile acestui proces sunt descrise de teoria coliziunilor. Datorită configurației instrumentale diferite, sunt posibile două tipuri principale diferite de CID: (i) de tip fascicul (în care ionii precursori sunt fragmentați în timpul zborului) și (ii) de tip capcană de ioni (în care ionii precursori sunt mai întâi prinși în capcană și apoi fragmentați).

Un al treilea și mai recent tip de fragmentare CID este disocierea prin coliziune de energie mai mare (HCD). HCD este o tehnică CID specifică spectrometrelor de masă orbitrap în care fragmentarea are loc în exteriorul capcanei de ioni, ea are loc în celula HCD (în unele instrumente denumită „ion routing multipole”). HCD este o fragmentare de tip capcană care s-a demonstrat că are caracteristici de tip fascicul. Există baze de date de spectrometrie de masă în tandem de înaltă rezoluție, disponibile în mod gratuit și la scară largă (de exemplu, METLIN cu 850 000 de standarde moleculare, fiecare cu date experimentale CID MS/MS), care sunt utilizate de obicei pentru a facilita identificarea moleculelor mici.

Metode de captare și transfer de electroniEdit

Energia eliberată atunci când un electron este transferat sau captat de un ion multiplu încărcat poate induce fragmentarea.

Disocierea prin captare de electroniEdit

Dacă un electron este adăugat la un ion pozitiv multiplu încărcat, se eliberează energia Coulomb. Adăugarea unui electron liber se numește disociere prin captare de electroni (ECD) și este reprezentată prin

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmente {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\left^{(n-1)+}}\right]^{*}{\ce {->fragmente}}}

pentru o moleculă M multiplu protonată.

Disocierea prin transfer de electroniEdit

Adăugarea unui electron printr-o reacție ion-ion se numește disociere prin transfer de electroni (ETD). Similar disocierii prin captare de electroni, ETD induce fragmentarea cationilor (de exemplu, peptide sau proteine) prin transferul de electroni către aceștia. A fost inventată de Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka și Jarrod Marto la Universitatea din Virginia.

ETD nu folosește electroni liberi, ci utilizează anioni radicali (de exemplu antracen sau azobenzen) în acest scop:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmente {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->fragmente}}}

unde A este anionul.

ETD scindează aleatoriu de-a lungul coloanei vertebrale peptidice (ioni c și z) în timp ce lanțurile laterale și modificările, cum ar fi fosforilarea, sunt lăsate intacte. Tehnica funcționează bine doar pentru ionii cu stare de încărcare mai mare (z>2), însă, în raport cu disocierea indusă de coliziune (CID), ETD este avantajoasă pentru fragmentarea peptidelor mai lungi sau chiar a proteinelor întregi. Acest lucru face ca tehnica să fie importantă pentru proteomica top-down. La fel ca și în cazul ECD, ETD este eficientă pentru peptidele cu modificări cum ar fi fosforilarea.

Transferul de electroni și disocierea prin coliziune cu energie mai mare (EThcD) este o combinație de ETD și HCD în care precursorul peptidei este supus inițial unei reacții ion/ion cu anioni de fluorantină într-o capcană ionică liniară, care generează ioni c- și z-. În a doua etapă, fragmentarea HCD a tuturor ionilor se aplică tuturor ionilor derivați din ETD pentru a genera ioni b- și y- înainte de analiza finală în analizorul orbitrap. Această metodă utilizează fragmentarea dublă pentru a genera spectre MS/MS bogate în ioni și, prin urmare, în date pentru secvențierea peptidelor și localizarea PTM.

Disociere prin transfer de electroni negativiEdit

Fragmentarea poate avea loc, de asemenea, cu o specie deprotonată, în care un electron este transferat de la specia respectivă la un reactiv cationic în cadrul unei disocieri prin transfer de electroni negativi (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmente {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragmente}}}

În urma acestui eveniment de transfer, anionul cu deficit de electroni suferă o rearanjare internă și se fragmentează. NETD este analogul ion/ion al disocierii prin detașare de electroni (EDD).

NETD este compatibil cu fragmentarea peptidelor și proteinelor de-a lungul coloanei vertebrale la nivelul legăturii Cα-C. Fragmentele rezultate sunt de obicei ioni produs de tip a– și x.

Disocierea prin detașare de electroniEdit

Disocierea prin detașare de electroni (EDD) este o metodă de fragmentare a speciilor anionice în spectrometria de masă. Ea servește ca un mod negativ de contracarare a disocierii prin captare de electroni. Ionii încărcați negativ sunt activați prin iradierea cu electroni de energie cinetică moderată. Rezultatul este ejectarea electronilor din molecula ionică mamă, ceea ce determină disocierea prin recombinare.

Disocierea prin transfer de sarcinăEdit

Reacția dintre peptidele încărcate pozitiv și reactivii cationici, cunoscută și sub numele de disociere prin transfer de sarcină (CTD), a fost demonstrată recent ca o cale alternativă de fragmentare cu energie ridicată pentru peptidele cu stare de sarcină scăzută (1+ sau 2+). Mecanismul propus de CTD folosind cationi de heliu ca reactiv este:

1 + + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmente {\displaystyle {\ce {{{1}+}+He+->}}}\left^{2}+}}}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmente}}}}.

Principalele rapoarte arată că CTD provoacă scindarea legăturii Cα-C din coloana vertebrală a peptidelor și furnizează ioni produs de tip a– și x.

FotodisociereaEdit

Energia necesară pentru disociere poate fi adăugată prin absorbția fotonilor, rezultând fotodisocierea ionilor și reprezentată prin

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}}.

unde h ν {\displaystyle h\nu }

reprezintă fotonul absorbit de ion. Se pot utiliza lasere ultraviolete, dar pot duce la fragmentarea excesivă a biomoleculelor.

Disocierea multifotonică în infraroșuEdit

Fotonii infraroșii vor încălzi ionii și vor provoca disocierea dacă sunt absorbiți suficient de mulți dintre ei. Acest proces se numește disociere multifotonică în infraroșu (IRMPD) și este adesea realizat cu un laser cu dioxid de carbon și un spectrometru de masă cu captare de ioni, cum ar fi un FTMS.

Disociere radiativă în infraroșu cu corp negruEdit

Radiația cu corp negru poate fi utilizată pentru fotodisociere într-o tehnică cunoscută sub numele de disociere radiativă în infraroșu cu corp negru (BIRD). În metoda BIRD, întreaga cameră de vid a spectrometrului de masă este încălzită pentru a crea lumină în infraroșu. BIRD utilizează această radiație pentru a excita vibrații din ce în ce mai energetice ale ionilor, până când o legătură se rupe, creând fragmente. Această metodă este similară disocierii multifotonice în infraroșu, care utilizează, de asemenea, lumina infraroșie, dar de la o sursă diferită. BIRD este cel mai adesea utilizată cu spectrometria de masă cu rezonanță ciclotronică ionică cu transformată Fourier.

Disocierea indusă de suprafațăEdit

Cu disocierea indusă de suprafață (SID), fragmentarea este rezultatul coliziunii unui ion cu o suprafață sub vid înalt. În prezent, SID este utilizată pentru a fragmenta o gamă largă de ioni. În urmă cu câțiva ani, se obișnuia să se utilizeze SID doar pentru speciile cu masă mai mică, cu sarcină unică, deoarece metodele de ionizare și tehnologiile analizoarelor de masă nu erau suficient de avansate pentru a forma, transmite sau caracteriza în mod corespunzător ioni cu m/z ridicat. De-a lungul timpului, suprafețele monostrat autoasamblate (SAM) compuse din CF3(CF2)10CH2CH2S pe aur au fost cele mai utilizate suprafețe de coliziune pentru SID într-un spectrometru tandem. SAM-urile au acționat ca cele mai dezirabile ținte de coliziune datorită maselor lor efective mari caracteristice pentru coliziunea ionilor care intră. În plus, aceste suprafețe sunt compuse din lanțuri rigide de fluorocarbon, care nu amortizează semnificativ energia ionilor proiectile. Lanțurile de fluorocarbon sunt, de asemenea, benefice datorită capacității lor de a rezista la transferul ușor de electroni de la suprafața metalică la ionii care intră. Capacitatea SID de a produce subcomplecși care rămân stabili și care oferă informații valoroase despre conectivitate nu este egalată de nicio altă tehnică de disociere. Deoarece complexele produse de SID sunt stabile și păstrează distribuția de sarcină pe fragment, acest lucru produce un spectru unic, spectru în care complexul se centrează în jurul unei distribuții m/z mai înguste. Produsele SID și energia la care acestea se formează reflectă intensitatea și topologia complexului. Tiparele unice de disociere ajută la descoperirea structurii cuaternare a complexului. Distribuția simetrică a sarcinilor și dependența disocierii sunt unice pentru SID și fac ca spectrele produse să fie distincte de orice altă tehnică de disociere.

Tehnica SID este, de asemenea, aplicabilă la spectrometria de masă cu mobilitate ionică (IM-MS). Trei metode diferite pentru această tehnică includ analiza caracterizării topologiei, a conectivității intersubunităților și a gradului de desfășurare pentru structura proteinelor. Analiza desfășurării structurii proteice este cea mai frecvent utilizată aplicație a tehnicii SID. Pentru spectrometria de masă cu mobilitate ionică (IM-MS), SID este utilizată pentru disocierea precursorilor activați la sursă a trei tipuri diferite de complexe proteice: proteina C reactivă (CRP), transthyretin (TTR) și concanavalina A (Con A). Această metodă este utilizată pentru a observa gradul de desfășurare pentru fiecare dintre acești complecși. Pentru această observație, SID a arătat structurile ionilor precursori care există înainte de coliziunea cu suprafața. IM-MS utilizează SID ca o măsură directă a conformației pentru fiecare subunitate a proteinelor.

Rezonanța ciclotronică ionică cu transformare Fourier (FTICR) este capabilă să ofere o rezoluție ultra-înaltă și o precizie ridicată a masei pentru instrumentele care efectuează măsurători de masă. Aceste caracteristici fac din spectrometrele de masă FTICR un instrument util pentru o mare varietate de aplicații, cum ar fi mai multe experimente de disociere, cum ar fi disocierea indusă de coliziune (CID, disocierea prin transfer de electroni (ETD) și altele. În plus, disocierea indusă de suprafață a fost implementată cu acest instrument pentru studiul fragmentării fundamentale a peptidelor. În mod specific, SID a fost aplicată la studiul energiei și cineticii fragmentării în fază gazoasă în cadrul unui instrument ICR. Această abordare a fost utilizată pentru a înțelege fragmentarea în fază gazoasă a peptidelor protonate, a ionilor de peptide cu electroni impari, a complecșilor ligand-peptidă necovalenți și a clusterelor metalice ligaturate.

.