Isolering och identifiering av flyktiga ämnen
Den mänskliga näsan uppfattar många flyktiga organiska föreningar som lukter och dessa lukter är ofta den första indikationen på att det finns mögel. Kemisk karakterisering (isolering, separering, identifiering och kvantifiering) av flyktiga organiska föreningar kräver dock specialiserade analysmetoder, som skiljer sig från de metoder som används i traditionell ”våt” kemi. Tekniska framsteg under slutet av 1900-talet och början av 2000-talet har förbättrat vår förmåga att upptäcka flyktiga ämnen exakt, noggrant och i låga koncentrationer (Zhang och Li, 2010; Hung et al., 2015). I korthet innebär traditionella metoder ångdestillation och vätske-vätskeextraktion, följt av koncentration och kemisk verifiering av enskilda föreningar. Några av de tidigaste studierna av VOC:s kemiska natur gjordes med hjälp av metylenkloridextrakt som koncentrerades genom ångdestillation och analyserades med gas-vätskekromatografi och masspektrometri (MS). I en tidig studie med denna metod analyserades VOC från Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae och Aspergillus parasiticus. Alla fyra arterna tillverkade 3-metylbutanol, 3-oktanon, 3-oktanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol och 2-octen-1-ol. För A. niger bestod över 90 % av den identifierade VOC-blandningen av 1-octen-3-ol, som är den luktförening som ger svampar sin karakteristiska lukt. För A. parasiticus utgjorde 1-octen-3-ol 35,6 % av den totala flyktiga blandningen, medan den besläktade föreningen med åtta kol, 2-octen-1-ol, som har en obehaglig must-oljelukt, utgjorde 34,8 % (Kamiński et al., 1974).
Metoderna har sedan dess förlitat sig på gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), som kombinerar kromatografisk separering, identifiering med hjälp av masspektrat och kromatografisk retention och kvantifiering av flyktiga prover. VOC i headspace från svampkulturer samlas vanligen upp av fasta sorptiva material, t.ex. aktivt kol eller en fiber. Varje insamlingsmetod har inneboende bias och kan möjliggöra artefaktbildning; i allmänhet skördas opolära föreningar företrädesvis framför polära föreningar. Gaskromatografi kan också ge upphov till fel genom att det ibland är svårt att skilja två föreningar från varandra, vilket leder till att de blandas ihop. Detta har noterats i fallet med 2-metyl-1-butanol och 3-metyl-1-butanol, isomerer som endast skiljer sig åt genom att en metylgrupp är omplacerad (Börjesson et al., 1992). Andra nackdelar med GC-MS-analysen är att den kräver skickliga operatörer, att den är relativt dyr och att den inte är effektiv när det gäller mer reaktiva flyktiga organiska föreningar (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao och Martin, 2002; Rappert och Müller, 2005).
Mikroextraktion i fast fas (SPME) är en populär och bärbar metod. VOC absorberas och koncentreras först på en fiber och levereras senare till detektorn där desorption sker i själva GC-injektorn. SPME är väl lämpad för att ta miljöprover som sedan transporteras tillbaka till laboratoriet för identifiering. Tillsammans med GC-MS är det ett bekvämt och allmänt använt sätt att kvalitativt identifiera flyktiga organiska föreningar från mikrobiella kulturer eller från förorenade byggnader (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń och Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME är ofta det bästa tillvägagångssättet för att bestämma den relativa mängden av en flyktig målförening i en utforskande situation eller för repetitiva provtagningsprocesser. Den är dock inte användbar för identifiering av nya föreningar.
Många specialiserade analysmetoder har utvecklats som kompletterar klassiska GC-MS-metoder och kan vara användbara för riktade analyser. Till exempel är protonöverföringsreaktion-masspektrometri (PTR-MS) användbar för att ta snabba prover och för att upptäcka låga koncentrationer (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Denna metod har använts inom miljövetenskap, livsmedelsteknik och medicinsk diagnostik (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Med hjälp av termisk desorption (TD)-gaskromatografi/masspektroskopi har in vitro-profilen av flyktiga metaboliter hos Aspergillus fumigatus karakteriserats, vilket visar på en distinkt signatur som innehåller monoterpenerna kamfen, α- och β-pinen och limonen samt sesquiterpenföreningarna α- och β-trans-bergamoten (Koo et al, 2014).
Selected ion flow tube-masspektrometri (SIFT-MS) har förmågan att upptäcka mikrobiella VOC med snabbhet och känslighet i en måttligt komplex gasblandning. Den kan rikta in sig på flyktiga organiska föreningar i låga koncentrationer i miljarddelar och kan mäta vissa föreningar i biljondelar. I den här tekniken joniseras de totala VOC:erna i ett flödesrör, vilket inte kräver kromatografisk separation (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Metoden har använts för att kvantifiera VOC som avges av A. fumigatus i kokultur med bakterier som ofta finns i sjuka mänskliga lungor. Kulturer med A. fumigatus producerade ”kopiösa” mängder ammoniak och de svavelorganiska föreningarna metanthiol (även känd som metylmerkaptan), dimetylsulfid och dimetyldisulfid (Chippendale et al., 2014).
Simultan destillationsextraktion (SDE) innefattar en kort kiseldioxidfiber som är täckt med organiskt material som stationär fas för att koncentrera VOC:er som sedan desorberas i en varm injektor. SDE har använts för att bestämma flyktiga komponenter i miljö-, livsmedels-, kriminaltekniska, olje-, läkemedels- och polymeranalyser för att få mer koncentrerade prover (Orav et al., 1996). Till exempel har vissa smakföreningar studerats med hjälp av en kombination av SDE och SPME. Aromföreningar kan analyseras kvantitativt med SDE medan SPME används för enkel, snabb och rutinmässig screening (Cai et al., 2001).
Multicapillär kolonn-jonrörlighetsspektrometer (MCC-IMS) har en känslighet på del per triljoner, hög hastighet och kräver låg teknisk kunskap. Karakteristiska metaboliter av A. fumigatus- och Candida-arter har differentierats i head space-analyser med denna metod (Perl et al., 2011).
Elektroniska näsor (e-noses) omvandlar flyktiga ämnen till elektriska signaler baserade på interaktion med elektroniska ytor och kan användas för att detektera kända föreningar. E-näsor består av en grupp kemiska sensorer med olika selektivitet, en signalförbehandlingsenhet och ett system för att urskilja mönster (Gardner och Bartlett, 1994). Olika flyktiga organiska föreningar bildar ett karakteristiskt fingeravtryck som kan särskiljas genom jämförelser med tidigare registrerade mönster i igenkänningssystemet. Den medicinska tillämpningen av e-näsor fokuserade ursprungligen på bakteriella patogener eller icke-infektiösa sjukdomar som lungcancer, kronisk obstruktiv lungsjukdom och astma (Valera et al., 2012). Beroende på tillämpningen används prover av flyktiga organiska föreningar från svabbar, sputum, serum, avföring, andedräkt eller urin för diagnostiska ändamål. Andningsprov har använts för tidig upptäckt av aspergillos (de Heer et al., 2013).
Det finns fortfarande många tekniska utmaningar när man arbetar med fungala VOC, och det är ofta svårt att jämföra resultat som erhållits mellan olika laboratorier. Samma svampart kan ha olika VOC-profiler baserade på okända eller okontrollerade miljö- och genetiska faktorer. Dessutom kan det experimentella protokoll som används drastiskt påverka VOC-profilen. I arbetet med Aspergillus flavus upptäckte de Lucca et al. (2010) till exempel endast en terpen genom att använda SPME för att samla in flyktiga ämnen innan de utsattes för GC-MS. Genom att senare använda en provkoncentrator innan de skickade proverna till en annan GC-MS-instrumentmodell kunde gruppen urskilja flera terpener (de Lucca et al., 2012). Metoden för hantering av material före experiment kan resultera i artefakter och autoklavering kan leda till att icke-biogena flyktiga ämnen bildas (Börjesson et al., 1992). Eftersom data ofta är inkonsekventa mellan olika försök har vissa författare ifrågasatt reproducerbarheten av mikrobiella VOC-utsläpp (Schleibinger et al., 2002). I framtida arbete med svampens VOC måste man vara medveten om de många faktorer som kan påverka resultaten. Det skulle vara bra om riktlinjer för bästa praxis utarbetades av forskargruppen som studerar svamp-VOC.