18O-märkning: ett verktyg för proteomik

Här presenteras en utvärdering av proteolytisk märkning och kvantifiering av proteiner för diagnostiska ändamål med hjälp av trypsin och 18O-berikat H2O. Vi visar att jämförande eller relativ kvantifiering kan utföras effektivt med detta tillvägagångssätt. Vi har utvecklat ett protokoll som gör det möjligt att bevara de märkta peptiderna i naturligt förekommande vatten utan rädsla för återväxling, förutsatt att pH-värdet är tillräckligt lågt för att släcka den katalytiska aktiviteten hos trypsin, men inte så lågt att det främjar kemisk återväxling. Eftersom märkningseffektiviteten beror på peptidernas beskaffenhet finns det inte något enkelt linjärt samband mellan den relativa 16O/18O-halten i digestbuffertblandningen (x) och märkningseffektiviteten (y), utan det följer snarare ett sannolikhetsbaserat samband y = x(2). Därför kan peptidmärkningen med hjälp av förhållandet mellan 16O/18O buffertblandningar för digestning avvika avsevärt från det förväntade resultatet baserat på ett linjärt förhållande. Utvärderingen av den relativa Ziptip-effektiviteten visade att provåtervinningen minskade när peptidkoncentrationen minskade under normala förhållanden, vilket tyder på att det finns en gräns under vilken avkastningen minskar. Dessutom visade adsorptionsförlusterna på grund av Speedvac-torkning och återvinning på blygsamma (20 %) förluster som kan variera kraftigt (0-50 %) från peptid till peptid. Uppslutningseffektiviteten i lösningen av standardproteinblandningar som en funktion av koncentrationen visade en linjär minskning med sjunkande koncentration. Detta stämmer överens med enzymkinetiska effekter och understryker ett potentiellt kvantifieringsfel som kan uppstå vid utvärdering av differentiellt uttryck baserat på peptiddetektion. Resultaten från våra studier visar kraften hos 18O-märkning som ett optimeringsverktyg för utveckling av proteomikprocesser.