Analys och kvantifiering av myoblastfusion in vitro med hjälp av LADD Multiple Stain

Vuxen muskelvävnad i skelettmuskulaturen innehåller en population av föregångsceller, s.k. satellitceller, som är ansvariga för reparationen av skelettmuskulaturen (1-3). Aktiverade satellitceller (myoblaster) migrerar till platsen för muskeltrauma, där de förökar sig, differentierar sig och fusionerar till flerkärniga myotuber (3-5). Den slutliga framgången för denna process mäts genom den grad i vilken de residenta myoblasterna har fusionerat under den terminala differentieringen.

För att experimentellt utvärdera myoblastfusion in vitro beräknas ett fusionsindex baserat på detektion av immunofluorescens med hjälp av mikroskopi. Fluorescensmärkta antikroppar används för att detektera muskelfiberstrukturella proteiner som myosin tung kedja (MyHC) och desmin, eller alternativt kan fluorescensmärkt phalloidin användas för att visualisera F-actin (6-9). Kärnorna är fluorescerande märkta med en DNA-bindande förening som Hoechst 33258. Därefter beräknas antingen procentandelen kärnor i myocyter med ≤3 kärnor (9) eller procentandelen kärnor i MyHC-positiva myotuber (10). Dessa metoder är väletablerade, men de kräver omfattande och tidskrävande optimering för att generera en stark och specifik signal för det aktuella antigenet och efterföljande fusionsanalys. Om fluorescensmärkta antikroppar används är tillgång till ett fluorescensmikroskop ett ytterligare krav som inte finns på alla institutioner. Efterföljande kvantifiering kräver mödosam och tidskrävande analys av många synfält för att få ett fusionsindex som är representativt för populationen. Dessa begränsningar, tillsammans med den relativa kostnaden för antikroppsbaserade analyser, fick oss att utveckla en snabb och kostnadseffektiv in vitro-analys för kvantifiering av myoblastfusion med hjälp av den allmänt tillgängliga LADD Multiple Stain.

LADD Multiple Stain (11) är en kombinerad kärn- och cytoplasmafärgning som innehåller fuchsin och toluidinblått (kat. nr 70955; LADD Research Industries, Williston, VT). För våra studier förbereds färsk LADD så att den innehåller 0,365 g toluidinblått (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) och 0,135 g fuchsin (Cat. #47860-25G; Sigma-Aldrich) i en slutvolym på 50 ml 30 % etanol. Lösningen blandas tills den är löst och filtreras sedan genom Whatman-filter (nummer 4) (kat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). LADD-färgen kan förvaras i en plast- eller glasbehållare i rumstemperatur och kan återanvändas. Celler som ska färgas tvättas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fixeras i 70 % etanol i 10 minuter. Etanolen avlägsnas och 500 µl LADD-färgämne tillsätts så att cellerna täcks helt och hållet. Cellerna inkuberas i 1 minut, varefter färgämnet avlägsnas och cellerna tvättas upprepade gånger med destillerat vatten tills LADD inte längre läcker ut i vattnet. Cellerna får sedan torka och förvaras i rumstemperatur tills de betraktas med hjälp av fas-kontrastljusmikroskopi. För att förbättra belysningen under visningen kan de färgade cellerna nedsänkas i PBS.

För att avgöra om denna färgning framgångsrikt kan användas för att visualisera myoblastfusion odlades C2C12-celler till 80 % konfluens (figur 1A) under standardodlingsförhållanden (12). Medierna ändrades sedan till differentieringsmedier innehållande 2 % hästserum, vilket resulterade i fusion till myotuber (figur 1B). Framgångsrik differentiering bekräftades genom ökat uttryck av MyHC (figur 1D) jämfört med odifferentierade celler (figur 1C). Efter LADD-färgning uppvisar de odifferentierade C2C12-myoblasterna en ljuslila cytoplasma och en mörkare kärna (figur 1E; pil). Efter differentiering framträder dock myotubernas cytoplasma som mörklila (figur 1F; pilspetsar), medan ljusare kärnor är tydligt synliga inom den flerkärniga cellen (figur 1F; pil). Efter LADD Multiple Stain observeras därför tydligt definierade kärnor som lika lätt kan särskiljas från cytoplasman i den flerkärniga myotuben (figur 1F) som den ses med hjälp av fluorescensmikroskopi efter immunocytokemi (figur 1D).

För att avgöra om bildanalys kan användas för att mäta framstegen i myoblastfusionen differentierades C2C12-celler i 6 dagar och bilder av LADD-färgade celler togs vid 200× förstoring med hjälp av ett Olympus CKX41 inverterat ljusmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Som förväntat ökade antalet fusionerande myocyter och myotuber tydligt vid varje efterföljande differentieringsdag (figur 2A). Ett fusionsindex beräknades sedan, och man såg att differentierande myoblaster stegvis ökade sitt fusionsindex från 0,45 % (dag 1) till 31,4 % (dag 6) (figur 2B). Det fusionsindex som härletts på detta sätt är positivt jämförbart med det index som beräknats med hjälp av standardimmunocytokemi (för att upptäcka MyHC) och kärnfärgning (13). För att avgöra om analysprogramvaran ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kunde anpassas för att kvantifiera myofibrernas area (som ett mått på fusion) utvecklades ett makro och testades på bilderna som representeras av figur 2A. Makroet ställs in på följande sätt och sparas sedan:

• Öppna ImageJ och klicka på ”Plugins = > Macros = > Startup Macros”

• Ersätt den befintliga texten med den kodning som visas i kompletterande tabell S1.

Bilderna öppnas i ImageJ och makrot körs genom att klicka på ”Macros = > Run Macro”. Detta kommer att analysera bilderna en i taget. Användaren måste bekräfta att tröskelvärdet har ställts in korrekt; endast myofiberområdet ska analyseras. Färgtröskeln kan ändras genom att redigera makroraden ”setThreshold(0,130)”; genom att öka det andra talet kommer fler lätt färgade områden att inkluderas, medan fler områden utesluts när detta tal minskas. Med hjälp av denna metod nådde myofiberområdet 29,6 % vid dag 6 (figur 2C), vilket stämmer väl överens med det fusionsindex som beräknades vid samma tidpunkt (figur 2B). Jenner- och Giemsa-färgämnen kan också användas för att färga myotuber för ljusmikroskopi på ungefär samma sätt som LADD, men färgning med LADD är många gånger snabbare och det ImageJ-makro som vi utvecklat ger större kontroll över vilka områden som mäts (14).

För att ytterligare validera användningen av LADD Multiple Stain för fusionsanalys differentierades C2C12-celler i 5 dagar i närvaro eller frånvaro av 10 µM BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) och därefter fixerades och färgades de med LADD enligt tidigare beskrivning. BB94 är en kommersiellt tillgänglig syntetisk matrixmetalloproteashämmare som tidigare har visat sig minska myoblastfusionen (15,16). I närvaro av BB94 minskade fusionsindexet signifikant från 50 % (DMSO-kontroll) till 22 % (P < 0,05) (figur 2D); analys av myofiberområdet visade samma trend, med en minskad fusion från 46 % (DMSO-kontroll) till 21 % (P < 0,05).05) i närvaro av BB94 (figur 2E).

Här presenterar vi en snabb, ny metod för färgning av både myofiberstruktur och associerade myonukleier med hjälp av LADD Multiple Stain. ImageJ används därefter för att noggrant utvärdera muskelfiberområdet som ett mått på fusion. Den relativt låga kostnaden för LADD och den kraftigt reducerade tid som krävs för bearbetning och analys innebär att fusion nu snabbt kan analyseras i ett standardlaboratorium utan behov av immunocytokemi och fluorescensmikroskopi.