Bakterieisolering

Introduktion

Det finns cirka 10 000 namngivna arter av mikrober. Man uppskattar att det finns mellan 10 000 och 100 000 fler oidentifierade arter för varje identifierad art. Det finns inte bara många typer av bakterier, det finns också många enskilda bakterier. En enda sked jord kan innehålla 100 miljoner enskilda bakterier. En skrapning av ditt tandkött kan ge 1 miljon bakterier per cm2 (en cm2 är ungefär lika stor som din lillfingernagel). Bakterierna i och på våra kroppar utgör ungefär 10 % av vår torra kroppsvikt.

De flesta av de för närvarande kända bakteriearterna har identifierats med hjälp av traditionella mikrobiologiska tekniker som gramfärgningsreaktion, morfologi och metaboliska reaktioner. Bakterier lever sällan ensamma utan i samhällen med andra bakterier. Detta gäller både i miljön och i och på våra kroppar. Den här kursen fokuserar på bakteriernas roll i sjukdomar. Att isolera en enskild bakterieart är det första steget för att identifiera de bakterier som eventuellt är ansvariga för en sjukdomsprocess.

Det första kravet för att fysiskt isolera en bakterie är att den kan odlas i laboratorium. Detta kräver kunskap om optimal temperatur för tillväxt, optimalt syrebehov och optimalt näringsbehov. Vi arbetar med ett mycket begränsat antal bakterier i den här kursen. De bakterier vi arbetar med är också mycket lätta att odla i laboratoriet. De flesta bakterier är inte så här trevliga!

Det finns två huvudsakliga sätt att isolera organismer.

1. Strömsättning för isolering på en agarplatta
2. Hällplattemetoden

Strömsättning för isolering på en agarplatta innebär successiv utspädning av organismer tills man har cellerna vid en tillräckligt låg densitet för att enskilda celler ska kunna isoleras fysiskt och rumsligt så att de ger upphov till igenkännliga individuella kolonier. I hällplattemetoden späder man ut sitt prov tillräckligt mycket innan man tillsätter det till smält, kyld agar och häller sedan denna blandning i en skål. De isolerade cellerna ger upphov till individuella kolonier som växer i själva agaren. Den här tekniken kan vara lite knepig. Om den smälta agaren är för varm dödar du alla bakterier. Om den smälta agaren är för kall får du en stor klump i din petriskål. Streckmetoden ger enskilda kolonier på agarens yta. Denna teknik är mycket snabbare och lättare att behärska.

Översikt

Du kommer att få ett buljongprov som innehåller tre organismer, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens och Escherichia. coli.

Alla tre organismer växer lätt aerobt på tryptisk sojaagar (TSA). S. marsescens bildar dock endast ett rött pigment vid 35°C eller lägre och optimalt vid rumstemperatur (25°C). Den växer mycket snabbt vid alla temperaturer till medelstora kolonier.

E. coli har ett brunt utseende vid alla temperaturer och är också en snabbväxare som bildar stora kolonier.

S. xylosus har ett gulorange utseende vid alla temperaturer, växer snabbt och bildar medelstora till stora kolonier.

Din förmåga att isolera och se de tre organismerna på din platta är beroende av lämpliga inkubationsförhållanden. Dina plattor kommer att inkuberas vid rumstemperatur i 48 timmar. Du bör kunna identifiera de tre organismerna baserat på kolonistorlek och pigment.

Material

• 1 blandkultur i TSB-rör (tryptic soy broth) innehållande Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens och Escherichia. Coli (alla BSL2)
• 3 TSA-plattor

Sträckning för isoleringsprocedur

Det finns flera metoder för ströning för isolering. De allra flesta av våra studenter har varit mest framgångsrika med kvadrantmetoden som beskrivs nedan.

1. Märk din platta med namn, datum, sektion och organism.
2. Använd BSL2-förfaranden för att få en loop-full av organismer från ditt TSB-rör (tryptic soy broth). Se protokollet för aseptisk teknik.
   • Se till att du har blandat ditt buljongerör ordentligt så att organismerna är jämnt suspenderade i buljongen.
3. Kappa igen ditt TSB-rör.
4. Du kan göra nästa del med din platta på laboratoriebänken eller med den i din hand. Du bestämmer själv vilket som fungerar bäst. Dra lätt din slinga fram och tillbaka över agarytan. (Se figur 1.)
   • Desto mer du drar desto mer bakterier deponerar du.
   • Den allmänna idén är att minska bakteriekoncentrationen med varje svep.
   • Fyra till fem sicksacksegel verkar fungera bra.
   • Experimenterar med dina olika plattor. Se till att hålla reda på vad du gjorde på varje platta.
5. Om du använder en förbränningsugn ska du sterilisera din slinga. Om du använder plastslingor, släng din använda slinga i kavicidbehållaren och skaffa en ny steril plastslinga.
6. Gå inte tillbaka till det ursprungliga buljongeröret.
7. Rör din slinga mot agarytan mot den bortre änden av din första strimma. Upprepa genom att dra fram och tillbaka.
   • o Dra inte in i mitten av plattan.
   • o Du bör kunna se de svaga intrycken av din strecklinje på agarytan.
8. Med hjälp av en steril slinga upprepar du proceduren på ditt andra streck.
9. Med hjälp av en steril slinga upprepar du proceduren på ditt tredje streck. Sicksacka den sista delen in i mitten av plattan.
   • Du bör få isolerade kolonier någonstans i din sista sträcka.
10. Om du använder en förbränningsugn ska du sterilisera din slinga. Om du använder plastslingor, släng din använda slinga i kavicidbehållaren.
11. Sätt tillbaka locket på din platta.
12. Placera dina färdiga plattor med agarsidan uppåt på inkuberingshyllan på det främre skrivbordet i inkuberingsavdelningen.

Figur 1: Kvadrantmetod för streaking för isolering.

Anmärkningar

• Det är absolut nödvändigt att du steriliserar din slinga mellan varje streaking, antingen genom att använda förbränningsugnen eller genom att skaffa en ny steril plastslinga. Detta är det vanligaste misstaget som elever gör.
• Lämna inte plattan öppen för länge, annars kommer extra bakterier från omgivningen att falla ner i din platta.
• Var inte besviken om du inte får isolerade kolonier vid första försöket. Detta är ett svårt förfarande.