Antikroppar med en enda domän, eller nanobodies, har nyligen hamnat i rampljuset som en potentiell behandling av COVID-19. Faktum är att en COVID-19 nanobody-baserad behandling som utvecklats av Beroni Group, ett australiskt bioteknikföretag, för närvarande befinner sig i preklinisk testning. Även om nanobodies först nu börjar inse sin terapeutiska potential har de studerats i årtionden.
År 1989 upptäckte två doktorander vid Vrije Universiteit Brussel genom en tillfällighet en unik egenskap hos kameldjur (bland annat kameler, lamor och alpacka). När de testade fryst kamelblodserum fann studenterna att kameldjur inte bara producerar konventionella antikroppar utan också en unik sekundär uppsättning enkelkedjiga antikroppar (scAbs) som består av två identiska polypeptider med tunga kedjor, som var och en innehåller två sammanhängande konstanta domäner, en gångjärnsregion och en variabel domän. (De konstanta domänerna i varje tung kedja löper parallellt; bortom gångjärnsregionen avviker de variabla domänerna som armarna på bokstaven ”Y”). Var och en av de variabla domänerna i scAb fungerar som en antigenbindande modul.
Denna spännande upptäckt var bara början. Efterföljande arbete visade att endast ett litet fragment av scAb, en enda variabel domän, krävs för att känna igen ett antigen. Detta fragment väger endast 12-15 kDa, därav namnet ”nanobody”.
Däremot består mänskliga antikroppar av två identiska polypeptider med tung kedja och två identiska polypeptider med lätt kedja. Dessa proteiner är stora, med en molekylvikt på cirka 150 kDa. Till skillnad från camelid scAbs sträcker sig den antigenbindande platsen för mänskliga antikroppar över både den tunga och den lätta kedjan (eller snarare de variabla domänerna i dessa kedjor), vilket innebär att alla kedjor behövs för att detektera ett antigen.
Fördelar med nanobodys
Då mänskliga antikroppar är stora har de ofta svårt att komma åt små bindningsutrymmen på virus, vissa celler och måltavlor djupt inne i tumörvävnad. De små nanobodies kan dock navigera i trånga utrymmen och kan vara ett attraktivt alternativ till mänskliga antikroppar för terapeutiska utvecklare. Dessutom är nanobodies bindningsdomän lång, vilket ger en ”fingerliknande” struktur som ökar nanobodies förmåga att nå sina mål.
En stor fördel med nanobodies, jämfört med konventionella mänskliga antikroppar, är att de är lätta att tillverka. Den relativt enkla processen börjar med immunisering av en kamelid med det önskade antigenet. Kamelidens immunsystem producerar ett scAb som känner igen antigenet. Ett blodprov tas därefter från kameldjuret (som i övrigt lämnas oskadat) och mRNA för scAb extraheras från provet.
Generna för den variabla antigenbindande domänen, det vill säga nanokroppen, amplifieras sedan från mRNA. Stora mängder av den slutliga nanobodyn kan sedan produceras inuti mikroorganismer, vanligtvis Escherichia coli, till en låg kostnad.
Nyare metoder tar djuren helt ur ekvationen genom att testa antigener mot ett förproducerat bibliotek av nanobodyner. Twist Bioscience erbjuder genom sin Twist BioPharma-division flera typer av nanobody-bibliotek inom ramen för ett lama scAb-ramverk eller ett delvis humaniserat scAb-ramverk. Miljarder nanobody-sekvenser kan testas samtidigt, vilket gör att upptäckt och utveckling av antikroppar går extremt snabbt och är relativt billigt.
Nanobody-tillämpningar
Ursprungligen användes nanobodies endast eller i första hand för forskningsändamål. Utforskningen av nanobodies användning som terapi har dock ökat dramatiskt under det senaste decenniet. I februari 2019 gjordes ett betydande framsteg när det första terapeutiska nanobody-läkemedlet godkändes av FDA.
Läkemedlet, kallat Cablivi, utvecklades av Ablynx för behandling av förvärvad trombotisk trombocytopenisk purpura. Cablivi fungerar som en anti-von Williebrand-faktor och förhindrar att trombocyter aggregeras kring organ.
Nanobodies för olika tillstånd är i klinisk prövning. Nanobodies utvärderas till exempel som behandlingar för psoriasis, reumatoid artrit och virusinfektioner.
Nanobodies kan förutom att utgöra soloterapier även bidra till kombinationsterapier. Av intresse är de kliniska prövningar som undersöker kombinationen av nanobodies och CAR T-cellterapier (chimär antigenreceptor) mot cancer.
CAR T-celler är genetiskt konstruerade för att känna igen och rikta in sig på antigener på ytan av tumörer. Hittills har CAR T-cellsterapier varit mycket lovande behandlingar för blodcancer som inte svarar på mer konventionella behandlingar. CAR T-cellsterapier har dock ännu inte varit framgångsrika mot solida tumörer.
För att ta sig an solida tumörer kan CAR T-celler behöva rikta in sig på alternativa måltavlor. De vanliga målen omfattar cancerspecifika antigener, som visar sig vara svåra att hitta, och cancerassocierade antigener, som är lättare att hitta men svårare att angripa på ett säkert sätt, eftersom de också förekommer på friska celler.
Dessa mål utgör ännu en annan svårighet. De är vanligen måltavlor för CAR T-celler som innehåller en antigenigenkänningsdomän som härrör från en mänsklig monoklonal antikropp. Mänskliga antikroppar kan dock orsaka immunogenicitet som leder till biverkningar och minskad effektivitet hos CAR T-cellerna.
Vilka alternativa mål kan vara lämpliga? Möjligheterna är många i den extracellulära matrisen, en väv av proteiner som skyddar solida tumörer och hyser immunosuppressiva molekyler. Tanken på att slå mot mål i den extracellulära matrisen tilltalade forskarna vid Boston Children’s Hospital. Till slut bestämde sig dessa forskare för att konstruera CAR T-celler med antigenigenkänningsdomäner som härrör från nanobodies.
Med hjälp av musmodeller av cancer visade forskarna att nanobody-baserade CAR T-celler endast är svagt immunogena och kan känna igen specifika antigener i tumörens mikromiljö. För att konstruera dessa CAR T-celler använde forskarna Gibson Assembly-metoden, en teknik som gör det möjligt att kombinera och klona flera DNA-fragment.
CAR T-cell-nanobody-konstruktioner kan skada tumörnärande blodkärl och tumörskyddande delar av den extracellulära matrisen. Skadan på tumörens mikromiljö bromsar tillväxten avsevärt och ger andra behandlingar, t.ex. kemoterapi, tillgång till tumörens insida.
Problem med utveckling av nanobodies
Det tog 30 år efter det att nanobodies upptäcktes 1989 innan ett terapeutiskt nanobody-preparat nådde marknaden. De första 10 åren inriktades på forskning om nanobodies struktur, sammansättning och egenskaper. Strax efter tioårsgränsen, 2001, försökte Vrije Universiteit Brussel kommersialisera nanobodies med flera patent utfärdade i dess namn. Dessa patent övergick senare till Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) och sedan till ett VIB-grundat företag, Ablynx, 2002.
Det är troligt att immaterialrättsliga begränsningar av nanobodyns sammansättning bidrog till den långa fördröjningen mellan upptäckten av nanobodyner och det första godkännandet av ett nanobodynbaserat läkemedel. De viktigaste patentkraven på denna biomolekyl gick dock ut 2014 i Europa och 2017 i USA, vilket gjorde det möjligt för Ablynx att avsevärt utöka sitt samarbete med några av världens största läkemedelsföretag, däribland Merck & Co, Boehringer Ingelheim och Sanofi.
Dessa samarbeten har resulterat i att en flodvåg av kliniska prövningar har registrerats som involverar nanobodies och det efterlängtade godkännandet av Cablivi. Dessutom har minskande immaterialrättsliga hinder i samband med nanobodies materiesammansättning gjort det möjligt för ännu fler företag att visa intresse för ytterligare kommersialisering av dessa supermolekyler.
Som alla terapier har nanobodies nackdelar. Deras lilla storlek resulterar i snabb clearance genom njurarna, vilket minskar deras halveringstid. För att säkerställa att en tillräckligt stor volym nanobodies finns i blodet för att uppnå önskad effekt krävs därför frekvent dosering, vilket kan framkalla njurtoxicitet. Det finns också en liten risk att patienterna kan få ett immunsvar mot terapeutiska nanobodies eftersom de är ett biologiskt material.
Troligtvis kan dessa problem övervinnas. Forskning har visat att fusionering av nanobodies med serumalbumin, ett rikligt förekommande transportprotein som finns i blodet, avsevärt ökar nanobodies halveringstid, vilket gör att de kan finnas kvar i blodet längre och i större mängder. Nanobodies immunogenicitet kan minskas genom humanisering, en process som modifierar vissa av nanobody-proteinsekvenserna för att öka deras likhet med mänskliga antikroppar, vilket minskar risken för en negativ immunreaktion.
Men även om det har funnits fördröjningar i kommersialiseringen av nanobodies som terapeutiska medel, nu när flera företag har möjlighet att investera i dessa underbara och unika molekyler, väntas det snart bli en explosion av nanobodies som används som terapeutiska medel för en mängd olika sjukdomar, från virusinfektioner till cancer. Camelid nanobodies har inte bara bevisat sitt värde utan kan också förändra landskapet för antikroppsterapi och leda till en ny generation av terapier.