Cellulära och molekylära reaktioner på akut kokainbehandling i neuronalliknande N2a-celler: potentiella mekanismer för dess motståndskraft vid celldöd

Material

Cellkultur

N2a-cellerna (CCL-131, ATCC) upprätthölls som en monolagskultur48 och har använts i stor utsträckning för studier av missbrukssubstanser14,49,50 eller CNS-sjukdomar som Parkinsons51 eller Alzheimers sjukdom47,52,53. En fördel med denna cellinje är att de fina morfologiska förändringarna till följd av kemisk exponering lätt kan upptäckas på grund av deras större cellstorlek. Om inget annat anges utfördes alla experiment i vår studie i fenolrödfritt RPMI-1640-medium innehållande 10 % FBS. Efter utsäde av celler i odlingsplattor eller tallrikar lät man dem växa 4-5 dagar i inkubatorn för spontan differentiering av neuritutväxter. Alla studier upprepades minst två gånger.

Morfologi

För grova cellmorfologiska utvärderingar fotograferades kristallviolettfärgade celler37 med hjälp av EVOS Cell Imaging Systems med ×40 objektiv. I vissa studier togs morfologi eller vakuoler av kristallviolettfärgade celler med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop IX-70 Olympus. Neuritutväxter kvantifierades med hjälp av programvaran image J (National Institutes of Health).

Elektrofysiologi

Helcells patch clamp användes för att registrera från N2a-celler som odlats på täckglas av plast. Täckglasen tvättades tre gånger med extracellulär inspelningslösning som innehåller (i mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukos och 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) och inkuberades i denna lösning vid rumstemperatur. Täckglasen lämnades antingen obehandlade eller behandlades med 6,25 μM eller 4 mM kokain direkt i den extracellulära lösningen under inspelningen. Glaselektroder (resistans 1-5 MΩ) fylldes med intracellulär lösning som innehöll (i mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES och 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4). Cellerna visualiserades under faskontrast med ett Nikon Eclipse Ti-U inverterat mikroskop och ansluten DS-Qi1 monokrom digitalkamera.

Inspelningar gjordes med en Axopatch 200B-förstärkare (Molecular Devices, CA) och digitaliserades med ett Digidata 1440A-system (Molecular Devices, CA). Joniska strömmar registrerades under ett spänningsklampsprotokoll (-60 till 135 mV i 15 mV-steg, 250 ms varaktighet). Spontana postsynaptiska strömmar registrerades med kontinuerlig spänningsklampning vid -80 mV i 2 minuter. Ett strömklampningsprotokoll (-100 till 200 pA i 20 pA-steg, 800 ms varaktighet) användes för att bedöma N2a-cellernas förmåga att avfyra aktionspotentialer som svar på ströminjektion. Signalerna filtrerades vid 1 kHz och samplades vid 10 kHz. Data samlades in och analyserades med hjälp av programvaran pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA).

Behandlingar

En känd mängd kokainhydroklorid löstes upp i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som en 1 M-stock strax före testerna. För att simulera farmakologiska kokainkoncentrationer in vivo, från 1 nM till 6,25 μM, framställdes flera arbetslager (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 och 400 μM) i PBS. För högre kokainkoncentrationer (2, 3 och 4 mM slutvärde) framställdes på samma sätt arbetslager på 80, 120 och 160 mM i PBS. Från varje arbetsmaterial tillsattes 5 μl kokain per brunn för att uppnå önskade koncentrationer och för att förhindra pH-förändringar i odlingsmediet37. Slutvolymen i varje brunn var 200 μl. Valet av lägre koncentrationer baserades på rapporter om nano till lägre mikromolär kokain i CNS-celler från missbrukare13 , medan de högre koncentrationerna baserades på flera in vitro-studier14,15,16 . Celler med enbart medium eller lika stor volym av vehikel (PBS) i medium fungerade som kontroller, medan medium utan celler togs som blank. Baserat på våra tidigare studier i C6 astroglialiknande celler6 utfördes kokainbehandlingar i den aktuella studien också under 1 timme för att möjliggöra en jämförelse. För övrigt avtar kokaineffekten hos missbrukare inom denna period för typiska mängder och intagsvägar33. I en del av experimenten förbehandlades cellerna i 96-hålsplattor med 1 µM YM155, en hämmare av genen survivin, i 30 minuter, följt av sambehandling med kokain (2-4 mM) i 1 timme och utvärderades med avseende på celllivslighet, medan cellerna i andra studier förbehandlades med 5 μM PIK-75, en hämmare av Nrf-224, i 30 minuter före sambehandling med kokain (2-4 mM) i 1 timme och utvärderades med avseende på celllivslighet och GSH-nivåer.

Viabilitet och vakuolering

Cellviabiliteten bedömdes genom upptag av kristallviolettfärgning enligt tidigare beskrivning54,55. Omfattningen av vakuolering i cellerna kvantifierades i glutaraldehydfixerade celler genom upptag av neutralt rött färgämne enligt tidigare beskrivning56. Färgämnet extraherades med 70 % etanol och 0,37 % saltsyra och absorbansen vid 540 nm togs i en plattläsare. Kristallviolettfärgade celler användes för fotomikrografi av vakuoler med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop IX-70 Olympus med ett ×40-objektiv.

Videomikroskopi

För live-videofilmning byttes en av de okulära linserna i det inverterade faskontrastmikroskopet IX-70 Olympus ut mot ett standardokulärt videokamerasystem. Utloppet från videokontakten kopplades till en dator för bildvisualisering på monitorn med hjälp av mjukvaruprogrammet Electronic Ocular -R-AMCap, som tillhandahålls av Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, Kina). Videodokumentation togs med en hastighet på 14 bilder per sekund.

Cellmembranintegritetsanalys

Cellmembranintegriteten bestämdes genom att mäta frisättningen av cytoplasmatisk LDH med CytoTox 96 non-radioactive assay kit (Promega, Madison, WI) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet behandlades cellerna i 96-håls-mikrotiterplattor med olika koncentrationer av kokain (2, 3 och 4 mM) i 1 h. Därefter överfördes 50 μl testmedium till en ny 96-hålsplatta, blandades med lika stor volym substratblandning från kitet och inkuberades i 30 min vid 37 °C. Absorbansen togs i en plattläsare vid 490 nm.

Mätning av intracellulära ROS

Celler i 96-hålsplattor behandlades med kokain vid 2, 3 och 4 mM i 1 h, följt av färgning med ett cellpermeabelt färgämne H2DCFDA (10 μM slutvärde) i 30 min6. Efter försiktig tvättning och lufttorkning av cellerna tillsattes PBS (100 μl/brunn). Plattorna avlästes med excitationsfiltret inställt på 485 nm och emissionsfiltret på 530 nm i en automatisk läsare (BioTek™ Synergy HTX multimode micro plate reader, BioTek Instruments, Winooski, VT).

Lipidperoxidationsanalys

Cellerna såddes med en starttäthet på 0,3 × 106 celler per brunn i plattor med sex brunnar. Lipidperoxidation mättes enligt tidigare beskrivning57. I korthet: Efter kokainbehandling med 2, 3 och 4 mM i 1 timme skördades cellerna och centrifugerades vid 13 000 varv per minut på en bordsmikrocentrifug i 6 minuter. Alla cellpellets sonicerades i PBS på is i 3 s och överfördes till glasrör. Därefter blandades lysaten med 30 % triklorättiksyra och 0,37 % tiobarbitursyra (TBA). Blandningen kokades i 10 minuter, kyldes till rumstemperatur (RT), överfördes till nya falcon-rör och centrifugerades vid 3038 × g i 10 minuter. Den klara supernatanten överfördes till en 96-hålsplatta och absorbansen vid 535 nm mättes i en mikroplattläsare. Klart medium utan celler användes som blankprov.

Allmän mitokondriell metabolisk aktivitet och membranpotential

Celler (2 × 104) behandlades med olika koncentrationer av kokain (2, 3 och 4 mM) under 1 timme i 96-håls mikrotiterplattor. Därefter centrifugerades plattorna vid 304 × g i 4 minuter och det kokainhaltiga mediet kasserades noggrant. Efter att omedelbart ha tillsatt färskt medium till cellerna (200 μl) tillsattes 10 μl MTS (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymetonfenol)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium, Promega) per brunn enligt tidigare rapport58 och inkuberades i 30 minuter vid 37 °C. Absorbansen togs i en mikroplattläsare vid 490 nm. Membranpotentialen bestämdes enligt det tidigare förfarandet46. I slutet av 1 timmes behandling med kokain överlagrades de monolagiga cellerna med 100 μl 0,25 % vattenhaltig glutaraldehyd för fixering, som innehöll Rh 123 för att ge en slutkoncentration på 2,6 μM i 30 minuter vid RT. Supernatanten kastades och plattorna tvättades med vatten och lufttorkades i huven. Slutligen tillsattes 100 μl 0,1 % Triton×100 i PBS per brunn och inkuberades vid 37 °C i 1 timme. Plattorna avlästes med excitationsfiltret inställt på 485 nm och emissionsfiltret på 538 nm på en BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode mikroplattläsare.

Laktatdetektion

Studier utförda på celler som odlats i medium innehållande 10 % FBS gav höga bakgrundsvärden på grund av seruminteraktion med vissa av kitets komponenter (Trinity Biotech, Jamestown, NY). I våra efterföljande studier ersattes därför före behandlingarna 10 % FBS-haltigt medium med reducerat serum (0,1 % FBS) i mikrotiterplattor med 96 brunnar (2 × 104 celler per brunn). Kittreagenset löstes upp i kromogen lösning som bestod av 5,3 mM vanillicsyra, 2,9 mM 4-aminoantipyrin och cirka 4 enheter pepparrotsperoxidas. I slutet av 1 h kokainbehandling tillsattes kitreagenset direkt till brunnarna (20 μl per 200 μl) och plattorna förvarades i inkubatorn vid 37 °C för färgutveckling (5-10 min). Absorbansen från de obehandlade cellerna togs som kontroll, medan mediet utan celler togs som blank. Absorbansen mättes vid 490 nm i en mikroplattläsare.

NMR-spektroskopi

Laktatfrisättning från cellerna detekterades genom proton (1H+) NMR-spektroskopi. Eftersom mängden serum inte stör denna metod använde vi 10 % FBS i medium i 96-brunns mikrotiterplattor (2 × 104 celler/200 μl per brunn). I slutet av 1 h kokainbehandling samlades mediet (0,15 ml per brunn) från alla upprepningar (n = 12) av varje behandling (1,8 ml) i de märkta rören. Medium från obehandlade celler användes som kontroll. Eftersom de behandlade proverna innehöll 2-4 mM kokain, tillsatte vi kokain (4 mM slutlig) till det tomma mediet. NMR-analyser utfördes på Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz) som är utrustad med en TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z-kryosond (den maximala z-fältgradientstyrkan är 48 G/cm). För att få fram ett endimensionellt (1D) NMR-spektrum förvärvades 16 transienter och adderades tillsammans med 3 s förvärvsfördröjning. Datapunkter (32 000) användes för att få en spektralbredd på 7500 Hz. Den dominerande vattentoppen vid 4,75 ppm i spektrumet eliminerades med hjälp av WATERGATE W5-pulssekvensen20. En bandbredd på 3 000 Hz längs varje sida av vattentoppen gavs som ett spektralt fönster för att observera lösta toppar genom att använda en fördröjningstid på 333,3 μs för WATERGATE-impulssekvenserna. En extern standard, 3,3 mM vattenhaltig DMSO-lösning, framställdes för kvantifiering av laktat i provlösningen.

Mätning av H2S i cellodlingsmedium

Celler såddes med en starttäthet på 2 × 104 per brunn i 96-hålsplattor. Före kokainbehandlingen tillsattes 1,64 % vattenhaltig zinkacetat59,60 (slutvärde: 0,041 %) till cellerna för att omvandla flyktig H2S-gas till zinksulfid under kokainbehandlingen. Efter en timmes behandling med 2, 3 och 4 mM kokain tillsattes 17,453 mM N,N-dimetyl-p-fenylendiaminsulfat i 7,2 M HCl (slutvärde: 2,55 mM) och 26,18 mM FeCl3 i 1,2 M HCl (slutvärde: 3,83 mM) till brunnarna och virvlades försiktigt. Bubblor i mediet avlägsnades genom att tillsätta 5 μl kall etanol till alla brunnar strax före avläsning av plattorna vid 670 nm i en mikroplattläsare.

ATP bioluminescensanalys

Celler i 96-håls-mikrotiterplattor behandlades med olika koncentrationer av kokain (2, 3 och 4 mM) i 1 timme. Total ATP mättes med hjälp av Bioluminescent ATP Somatic cell assay kit (FLASC, Sigma-Aldrich) enligt instruktionerna från tillverkaren. I korthet, i slutet av behandlingen tillsattes 75 μl av Somatic Cell ATP releasing solution per brunn för att lysera cellerna. Därefter överfördes 50 μl lysat till nya vita 96-brunnsplattor med klar botten, som redan innehöll 50 μl ATP-analysblandning med enzym under reducerat ljus. Luminescensen mättes omedelbart på en BioTek™ Synergy™ HTX multi-mode mikroplattläsare.

Isolering av RNA och cDNA-syntes

Cellerna såddes med en densitet på 2 × 106 i odlingsskålar med 100 mm diameter. Vid behandlingstillfället nådde cellerna cirka 65-70 % konfluens. Efter 1 h behandling med 2-4 mM kokain skördades cellerna genom skrapning och centrifugerades vid 1125 × g i 5 minuter. Totalt RNA isolerades enligt tillverkarens protokoll (Qiagen Sciences, German town, MD) med hjälp av RNeasy mini spin-kolonner. DNase I-behandling (Qiagen Sciences) utfördes på kolonnen. Totalt RNA från kolonnen eluerades med 20 μl RNasfritt vatten. För kvantifiering späddes RNA på is i RNasfritt vatten i förhållandet 1:10. Mängden totalt RNA mättes med spektrofotometern Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). RNA visade en kvot på >1,95 vid 260/280 nm och användes därefter för cDNA-syntes. Ett mikrogram totalt RNA användes för att producera cDNA med hjälp av ett iScript cDNA-synteskit (Bio-Rad, Hercules, CA) enligt tillverkarens anvisningar.

Relativt uttryck genom kvantitativ RT-PCR

Genuttrycksanalys av Nrf-2, survivin (Birc5) och GAPDH med hjälp av qPCR utfördes i en iCycler termisk cyklare med MyiQ-detektionssystem (Bio-Rad) med iQ SYBR Green supermix. Nrf-2, survivin och GAPDH-produkter syntetiserades genom separata PCR-reaktioner som utfördes i 20 μl slutvolym med 2 μl cDNA-prov och 500 nM specifika primers. Cykelförhållandena var följande: 95 °C i 10 minuter, följt av 40 cykler av 95 °C i 15 s, 55 °C i 30 s och 72 °C i 30 s, medan smältkurvanalysen efter PCR utfördes vid 55-95 °C. Den relativa kvantifieringen av genuttryck utfördes enligt 2-△△CT-metoden61 med GAPDH som endogen kontroll. Primersekvenserna som användes för analyserna visas i tabell 1.

Total GSH-analys

Efter att ha behandlat med olika koncentrationer av kokain (2-4 mM) i fullständigt medium i 1 timme i 96-brunns-mikrotiterplattor fixerades cellerna med 0,25 % glutaraldehyd i 30 minuter, följt av försiktig tvättning tre gånger, och lufttorkades. Totalt cellulärt GSH analyserades enligt tidigare beskrivning62. Absorptionen mättes vid 412 nm i en mikroplattläsare.

Förberedelse av lysat av hela celler

För enzymanalyser såddes cellerna med en densitet på 2 × 106 i odlingsskålar med en diameter på 100 mm. Efter 1 h behandling med 2-4 mM kokain skördades cellerna med hjälp av cellskrapor. Efter centrifugering vid 1620 × g i 5 minuter förvarades cellpelletsen vid -70 °C tills vidare. På dagen för testerna återuppsammades pelletsen i 0,5 ml PBS och sonicerades två gånger på is i 15 s. Innehållet överfördes till eppendorfrör och mikrocentrifugerades vid 5 000 rpm i 5 minuter. Supernatanterna överfördes till nya rör och användes för enzymanalyser. Proteinkoncentrationen i varje lysat bestämdes med hjälp av BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL) enligt tillverkarens anvisningar med bovint serumalbumin som standardreferens.

Catalase assay

Det analyserades enligt tidigare metod63. Reaktionsblandningen (450 μl) i en kvartskuvett innehöll 50 μl celllysat (60 μg), 250 μl 50 mM fosfatbuffert (pH 7,0). Reaktionen startades genom tillsats av 150 μl 30 mM H2O2 (10 mM slutlig). Absorbansminskningen vid 240 nm övervakades under 2 minuter i en Genesys 10 S UV-Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL). Enzymaktiviteten beräknades med hjälp av extinktionskoefficienten 0,00706 per mmol per mm och enheten för enzymaktivitet uttrycktes som mmol H2O2 som bryts ned per minut per mg protein. Sedan jämfördes enzymaktiviteten hos behandlade prover med kontrollen (100 %).

GPx-analys

Den analyserades enligt den publicerade proceduren64. Reaktionsblandningen (500 μl) innehöll 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 enheter glutationreduktas (GR), 0,1 mM natriumazid i 0,1 M kaliumfosfat (pH 7,0) med 1 mM EDTA. Natriumazid tillsattes till reaktionsblandningen för att hämma den endogena katalasaktiviteten. Reaktionsblandningen inkuberades med 60 μg prov i 10 minuter utan NADPH, och reaktionen startades genom tillsats av NADPH och H2O2 i en slutkoncentration på 150 μM. NADPH-konsumtionshastigheten övervakades vid 340 nm i 3 minuter. En enhet GPx-aktivitet definierades som den mängd enzym som krävs för att förbruka 1 μmol NADPH/min i den kopplade analysen och aktiviteten uttrycktes per mg protein. Därefter jämfördes enzymaktiviteten hos behandlade prover med kontrollen (100 %).

Statistisk analys

De experimentella resultaten (n = antal brunnar sammanställda från minst två olika experiment) presenterades som medelvärde ± SEM. Alla stapeldiagram ritades med hjälp av GraphPad Prism Software, version 3.00 (San Diego, CA). Data analyserades för signifikans genom envägs ANOVA och jämfördes sedan med hjälp av Dunnetts eller Bonferronis multipla jämförelsetest. Testvärdena P < 0,05 och P < 0,01 betraktades som signifikanta respektive mycket signifikanta.