Clonogenic assay: vad, varför och hur

En clonogenic assay, även kallad colony formation assay

är en in vitro cellöverlevnadsanalys. Det bedömer enskilda cellers förmåga att överleva och reproducera sig för att bilda kolonier.1 Försöket beskrevs för första gången på 1950-talet, där det användes för att studera effekterna av strålning på cancercellers överlevnad och tillväxt, och har därefter spelat en viktig roll inom radiobiologin.2

För att mäta klonogenicitet måste cellerna sättas ut i mycket låga tätheter och lämnas under en period av 1-3 veckor för att kolonier ska kunna bildas. Kolonierna fixeras sedan, färgas med kristallviolett för att göra dem synliga och räknas. Cellöverlevnadskurvor ritas upp för att analysera data. Idag används klonogena tester för att besvara en mängd olika experimentella frågor, särskilt inom cancerbiologin.

Denna blogg belyser:

Hur man utför en klonogenic assay med viktiga överväganden att göra på vägen

Användning av märkningsfri mikroskopi och konfluensdetektering för att bedöma koloniernas antal och storlek med hjälp av automatiserad bildkvantifiering

Den klonogena överlevnadsanalysen

Klonogena assays används i stor utsträckning inom cancerforskningen, eftersom bildandet av kloner tolkas som ett kännetecken hos cancerceller med tumörinitierande förmåga. Denna test användes ursprungligen inom radiobiologin, men har blivit ett standardverktyg inom cancerforskningen för att utvärdera celltillväxt och de cytotoxiska eller genotoxiska effekterna av olika medel med potentiell klinisk tillämpning. Detta inkluderar kemoterapeutiska medel och riktade terapier som enskilda medel eller i kombination 3.

Clonogen tillväxt används också för att utvärdera stamning av särskilda cellpopulationer, eftersom stamceller är långlivade celler med potential för kontinuerlig proliferation. Detta är särskilt relevant för cancerforskning eftersom cancerstamceller ofta förknippas med kemoresistens, bildande av sekundära tumörer och återfall i cancer. Att undersöka cancerstamceller med hjälp av en klonogenic analys är därför ett värdefullt och allmänt använt verktyg för att förutsäga effekten av en viss behandling.4

Klonogenic analyser mäter cellernas förmåga att behålla sin reproduktiva integritet under en längre tidsperiod. Detta är en viktig egenskap eftersom den avslöjar fenotypiska effekter som kräver tid och eventuellt flera celldelningar för att utvecklas. Vid analys av terapeutisk resistens är detta särskilt viktigt. Läkemedelsresistens kan inte identifieras med hjälp av kortsiktiga cytotoxicitetsanalyser.5

Hur man utför en klonogenic assay

Informationen i det här avsnittet är anpassad från Franken et al. (2006) som publicerade ett protokoll för klonogenic assay i Nature Protocols1, kombinerat med vissa insikter från min egen erfarenhet från att ha utfört över 60 klonogenic assays under min doktorandtid.

Det finns i princip två olika sätt att utföra en klonogenic assay:

(1) Celler kan sättas ut vid låg densitet och sedan behandlas för att undersöka behandlingens effekt på cellernas klonogenicitet.

(2) Celler kan behandlas under en bestämd tidsperiod och sedan återigen odlas med låg densitet i behandlingsfria medier för att testa den klonogena förmågan.

Det senare används ofta för att bedöma terapeutisk resistens efter behandling. Figur 1 sammanfattar det första tillvägagångssättet som är den traditionella metoden för att utföra en klonogenic test. Som kommer att framgå är detta en tidskrävande metod som inte ger någon information om experimentets utveckling (endast slutpunkt). Vi kommer att diskutera automatiserade och alternativa metoder utan slutpunkt senare.

Traditionellt protokoll för klonogenicitetsförsök

Figur. 1 | En sammanfattning av ett traditionellt protokoll för klonogenicitet där celler sätts ut, behandlas och sedan klonogenicitet bedöms.

Clonogenic assays utförs vanligtvis i plattor med 6 eller 24 brunnar. Cellerna måste placeras sparsamt och jämnt så att isolerade kolonier kan bildas. Därför är det viktigt att optimera din såddtäthet för den valda brunnsstorleken innan du utför din klonogena analys.

En bra utgångspunkt är att titta i litteraturen för att se om några studier har utfört klonogena analyser med din cellinje och sedan testa denna såddtäthet och två eller tre andra. Under denna optimeringsprocess är det också viktigt att ta hänsyn till din experimentella slutpunkt (t.ex. 7 dagar, 14 dagar eller 21 dagar) och celltillväxthastighet eftersom du inte vill ha sammanfogade kolonier, vilket kommer att störa kolonikvantifiering och analys. Såddtätheterna bör vara desamma för alla behandlingsförhållanden i ditt experiment.
Att använda rätt kontroller är avgörande för analysfasen. Man bör alltid använda en obehandlad kontroll samt en kontroll som enbart består av vehikel (detta kan vara DMSO, PBS eller vilket lösningsmedel som din behandling är löst i). För behandlingsförhållanden används ofta en utspädningsserie. Behandlingsperioden och behandlingens hårdhet hjälper till att bestämma koncentrationsintervallet – detta kommer sannolikt att kräva en viss optimering. Varje kontroll- och försöksbetingelse bör utföras i tre exemplar.

Under kolonibildningsfasen måste du övervaka kolonitillväxten under alla behandlingsbetingelser. En koloni anses vara 50 celler eller mer och de är endast synliga i mikroskop. Eftersom den här analysen vanligtvis pågår under en lång period måste du byta cellmedium. Cellerna kommer att ha en mycket låg konfluens till att börja med, så du behöver inte byta media så regelbundet som normalt. Men om du sätter ut och sedan behandlar med ett läkemedel eller en förening är det viktigt att ta hänsyn till dess halveringstid och lägga till ny behandling vid behov.

För forskare som är intresserade av att avbilda kolonins tillväxt över tid. Vi rekommenderar att man tittar på CytoSMART Omni.

—————–

Det är ofta kolonierna under kontrollförhållandena som växer snabbast och därför kan du använda dessa celler som en indikation på din experimentella slutpunkt, dvs. avsluta experimentet innan dina kolonier börjar slå sig samman och om detta sker för snabbt, använd hellre en lägre utsädesdensitet för ditt experiment. Det är viktigt att avsluta försöket för alla behandlingsförhållanden samtidigt.

När du har nått experimentets slutpunkt måste cellerna tvättas försiktigt med PBS (tillsätt PBS vid sidan av brunnen för att inte störa kolonierna), fixeras och färgas med det DNA-intercalerande färgämnet kristallviolett (0,5 % w/v) i minst 30 minuter. Det kan vara kladdigt att ta bort överskottsfärgen. Den bästa tekniken är att försiktigt doppa plattorna i bägare nedsänkta i vatten tills allt överflödigt färgämne har avlägsnats och du bara har kvar ljuslila kolonier. Färgade kolonier kan räknas upp till 50 veckor efter färgningen. Ta högupplösta bilder av dina brunnar som du kan använda för analys, presentationer och publikationsfigurer.

För att stödja forskare i analys och optimering av deras kolonibildningsanalyser har CytoSMART introducerat en applikation för CytoSMART Omni för att detektera kolonier i (time-lapse) bilder av hela brunnsplattor vid 10X förstoring. I inkubator kan time-lapse-bilder ge kinetisk information snarare än slutpunkt, vilket kan ge mer detaljerad information om när behandlingen börjar påverka cellerna. Etikettfri bildanalys används för att upptäcka kolonier, utvärdera deras storlek och cirkularitet. Man kan fastställa när kolonierna börjar gå samman och optimera i enlighet med detta.

Hur du analyserar din klonogena analys

Det är verkligen så enkelt som att manuellt räkna kolonierna för varje behandlingstillstånd och representera data som en överlevnadskurva (du bör använda minst tre biologiska upprepningar för din kurva).

En överlevnadskurva kräver att den överlevande fraktionen (SF) av behandlade celler (detta inkluderar ett förhållande mellan bildade kolonier och sådda celler) beräknas och plottas mot behandlingsdosen. Innan du kan beräkna SF måste cellernas utplanteringseffektivitet (PE) bestämmas eftersom olika cellinjer har olika utplanteringseffektivitet och detta påverkar beräkningen av överlevnadsfraktionen.

PE är förhållandet mellan antalet kolonier och antalet celler som såtts i dina obehandlade celler1. Figur 1 visar PE- och SF-formlerna och ett exempel på en överlevnadskurva.

Den manuella räkningen av kolonier är tröttsam och kan vara utsatt för bias, så ett antal fritt tillgängliga datoriserade bildanalysverktyg har utvecklats för att snabbt och objektivt analysera bilder från klonogena analyser. Ett värt att nämna är det fritt tillgängliga mjukvarupaket som utvecklats av Brzozowska et al. (2019) som inte bara räknar kolonier utan även plottar deras storleksfördelningar, vilket är ytterligare ett lager av användbar information om cellbeteende (se figur 2a).6

Ett alternativ till att räkna och kvantifiera enskilda kolonier är att bestämma procentandelen av brunnsytan som täcks av kolonier (procentandel av koloniytan) för att kvantifiera klonogen celltillväxt. Guzmán et al. (2014) har utvecklat ett fritt tillgängligt ImageJ-plugin kallat ColonyArea som gör just detta (se figur 2b).7 Detta är ett användbart verktyg att använda om du har sammanslagna kolonier som är svåra att räkna med ögat eller med hjälp av programvara för koloniräkning, eller om du vill ha en snabb analysmetod med hög genomströmning.

Figur. 2 | Fritt tillgängliga verktyg för mätning av klonogena analyser. (A) Brzozowska et al. har utvecklat en programvara (countPHICS) som räknar kolonier och mäter kolonnstorlek.6 (B) Guzmán et al. har utvecklat en ImageJ-plugin, ColonyArea, som kvantifierar koloniväxtens area och färgningsintensitet.7

Märkningsfritt, icke-slutpunktsbaserat, halvautomatiserat protokoll för klonogena analyser

I en nyligen publicerad artikel av Mayr et al. (2018) beskrivs ett nytt och modifierat protokoll för klonogena analyser där man använder sig av ett 96-väggars mikroplattformat och konfluensdetektion för att mäta kolonier. Denna metod möjliggör omfattande experimentella uppställningar med hjälp av en 96-well-platta, den är märkningsfri, har ingen slutpunkt för färgning och analysen är halvautomatisk (figur 3)8. Dessutom visade tidsupplöst konfluensmätning utan slutpunkt i samma brunn att den halvautomatiska analysen var lämplig för att bestämma koloniantal och medelstorlek.

Figure. 3 | Mayr et al. utvärderade den klonogena tillväxten i 96-brunnsformatet över tid med hjälp av konfluensdetektering8. Grafen visar kvantifiering av klonogen tillväxt vid olika tidpunkter och bilderna visar specifika brunnar med konfluensdetektering. Gröna fläckar representerar områden som upptäcks av en konfluensläsare och orange pilar indikerar sammanslagna kolonier.

Denna metod för klonogena analyser ger ett tids- och kostnadseffektivt alternativ till standardprotokollet för klonogena analyser. Eftersom det inte krävs någon slutpunktsfixering och färgning möjliggör detta protokoll kontinuerlig övervakning och analys av klonogen tillväxt. Dessutom kan ytterligare mätvärden om kinetiken för koloniväxter också extraheras under experimentet. Det miniatyriserade formatet öppnar också möjligheten att testa dyra behandlingar som siRNA-baserade eller CRISPR/Cas9-baserade terapier som inte skulle vara genomförbara med den behandlingsvolym som krävs för en 6- eller 24-brunnsplatta. I slutändan visade Mayr et al. att märkningsfri mikroskopi med konfluensdetektion är ett robust och genomförbart alternativ för att mäta klonogenicitet.

En märkningsfri, icke slutpunkt och automatiserad lösning för dina klonogenicitetsanalyser är CytoSMART Omnimed sin algoritm för kolonidetektion. Kolonibildning mäts över tiden över en hel brunn med avläsning av koloniantal, storlek och cirkularitet. Dina celler behöver inte lämna inkubatorn och cellulär kinetisk information under kolonibildningsprocessen kan erhållas (figur 4).

Figur 4 | Automatiserad kolonidetektion med hjälp av CytoSMART Omni. HEP-G2 levercancerceller i en 24-hålsplatta avbildades under 75 timmar med hjälp av CytoSMART Omni som förvaras i en vanlig CO2-inkuberingsmaskin. Bilden visar en full brunn efter att algoritmen för kolonidetektering kördes med kluster av celler som markeras av den orangefärgade kolonimasken. Koloniernas antal, storlek och cirkularitet mättes under hela testet och visas i graferna.

Lär dig mer om alla CytoSMART bildbehandlingslösningar här

.