Effekt av oralt administrerat vattenextrakt från Atractylodes macrocephala Koidz på makrofager och T-cellers inflammatoriska svar hos möss

Abstract

Rhizomet av Atractylodes macrocephala Koidz (AM) är en beståndsdel i olika recept med Qi booster-preparat. Vi utvärderade inflammatoriska reaktioner i makrofager och T-celler isolerade från möss efter oral administrering av AM vattenextrakt (AME). Peritoneala exudatceller isolerades från möss som injicerats med tioglykollat och förändringar i scavengerreceptorer undersöktes. Peritoneala makrofager stimulerades med lipopolysackarid (LPS). Serumcytokinsvar på intraperitoneal LPS-injektion utvärderades också. Splenocyter isolerades och deras sammansättning och funktionella svar mättes. Innehållet av atractylenolid I och atractylenolid III, kända antiinflammatoriska ingredienser, i AME var 0,0338 mg/g extrakt respektive 0,565 mg/g extrakt. AME ökade antalet SRA(+)CD11b(+)-celler som svar på tioglykollat. Peritoneala makrofager isolerade från AME-gruppen visade inga förändringar i inflammatoriska markörer såsom tumörnekrosfaktor- (TNF-) α, interleukin- (IL-) 6, inducerbart kväveoxidsyntas och cyklooxygenas-2 men uppvisade en minskning av CD86-uttrycket. Intressant nog minskade AME serumnivåerna av TNF-α och IL-6 vid intraperitoneal injektion av LPS. När det gäller det adaptiva immunsystemet ökade AME CD4(+) T-cellspopulationen och uttrycket för major histokompatibilitetskomplexets klass II-molekyl i mjälten, och odlade splenocyter från AME-gruppen uppvisade en ökad produktion av IL-4 samtidigt med en minskad interferon-γ-produktion under aktivering av T-celler. AME främjade återfyllnaden av peritoneala makrofager under det inflammatoriska svaret, men dess antiinflammatoriska aktivitet tycktes inte förmedlas av en modulering av makrofagaktiviteten. AME förändrade också immunstatusen hos CD4 T-celler och främjade Th2-svaret.

1. Introduktion

Inflammation är ett skyddande svar för att eliminera skadliga stimuli, och immunceller är de viktigaste deltagarna i denna process. Beroende på modaliteten för antigenigenigenkänning och förmågan att generera minnessvar delas immuncellerna in i det medfödda immunförsvaret och det adaptiva immunförsvaret . Medfödda immunceller som makrofager och dendritiska celler reagerar omedelbart på antigener med begränsad receptorspecificitet . Adaptiva immunceller, som består av T-celler och B-celler, är antigenspecifika, inleder ett svar på antigen som har trängt in i den perifera lymfoida vävnaden och genererar ett minnessvar . De medfödda immuncellerna är huvudaktörer i de tidiga stadierna av inflammation, men med tiden tar de adaptiva immuncellerna över.

Vävnadsinterna makrofager spelar en nyckelroll för immunitet och vävnadsintegritet . De flesta vävnadsmakrofager härstammar från embryonala prekursorer . Under stabila förhållanden upprätthålls deras populationer genom deras livslängd och genom lokal proliferation, och vissa makrofager fylls på av blodets monocytderiverade celler . Vid inflammation rekryteras monocyter från benmärgen till platsen och differentieras till makrofager . Makrofager eliminerar patogener och antigener genom fagocytos och framkallar inflammatoriska reaktioner genom att producera cytokiner och enzymer som tumörnekrosfaktor (TNF-) α, interleukin (IL-) 6, inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) och cyklooxygenas (COX-) 2. Dessutom är makrofager en typ av professionella antigenpresenterande celler (APC) som presenterar antigener för T-celler .

T-celler, som huvudsakligen består av CD4 T-celler och CD8 T-celler, aktiveras när T-cellsreceptorer (TCR) kommer i kontakt med antigena peptider som är bundna till MHC-molekyler (major histocompatibility complex) på APC . CD4 T-celler, som utgör mer än två tredjedelar av T-cellerna, kan differentieras till olika effektor T-hjälparceller (Th-celler), t.ex. Th1, Th2, Th17, follikulära T-hjälparceller och T-regulatoriska celler . Bland dessa undergrupper var Th1- och Th2-celler de första typerna som definierades. Th1-cellerna utsöndrar höga nivåer av interferon- (IFN-) γ och är effektiva i försvaret mot intracellulära patogener genom att aktivera makrofager, medan Th2-cellerna utsöndrar interleukin- (IL-) 4, IL-5 och IL-13 och skyddar värden mot helminthinfektioner genom att rekrytera eosinofiler och mastceller . Även om dessa T-hjälparceller är viktiga för värdförsvaret kan kronisk aktivering av någon Th-cellstyp orsaka immunmedierade sjukdomar. Th1-celler spelar en avgörande roll vid organspecifik autoimmunitet och kroniska inflammatoriska sjukdomar och Th2-celler är ansvariga för allergisk inflammation .

Rhizomet av Atractylodes macrocephala Koidz (AM), som tillhör Compositae, har använts för behandling av funktionella defekter i matsmältningssystemet, såsom aptitlöshet, bukspridning och diarré. Enligt traditionell kinesisk medicin stärker AM Qi genom att lösa onormal vätskeretention i mag-tarmkanalen. AM är en beståndsdel i olika recept med Qi booster-medel. Enligt traditionell kinesisk medicin är en av Qi:s viktiga funktioner försvaret. Av denna anledning anses Qi boostande örter stärka immunförsvaret. Eftersom qi-stärkande örter tas i förebyggande syfte för att förbättra immunstatusen hos personer utan uppenbara defekter är det nödvändigt att utvärdera hur immunförsvaret kan förändras hos normala individer efter administrering av AM. Trots dess frekventa användning har det gjorts få studier för att utforska effekterna av AM på immunsystemet.

AM innehåller flera bioaktiva sesquiterpenoider såsom atractylenolid I, atractylenolid II och atractylenolid III och polyacetylenes . In vitro behandling av makrofager med atractylenolid I, atractylenolid III och vissa polyacetylenföreningar hämmade lipopolysackarid (LPS) inducerat TNF-α och iNOS-uttryck . Oral administrering av dessa lipidlösliga komponenter visade antiinflammatorisk aktivitet hos möss . Majoriteten av traditionella örtpreparat är dock vattenbaserade avkok, vilket resulterar i ett lågt utbyte av farmakologiskt aktiva lipidlösliga komponenter. Dessutom kan polyacetylenerna lätt förstöras i kokande vatten. Därför ville vi undersöka om antiinflammatoriska reaktioner uppstår i makrofager som isolerats från möss som fått AM extraherat i kokande vatten (AME). Vi undersökte också effekten av AME på det inflammatoriska svaret i serum. Slutligen undersökte vi splenocyternas sammansättning och funktionella svar för att se om det adaptiva immunsystemet förändrades efter tillskott av AME.

2. Material och metoder

2.1. Beredning av prov

AM med ursprung i Eusung (Sydkorea) köptes från E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, Sydkorea). Ett värdebevis (# 2013-AM) har deponerats i Laboratory of Herbal Immunology, Kyung Hee University. 100 g av provet maldes, extraherades med 1 liter avjoniserat vatten (DW) i en återflödesapparat och värmemantel i 2 timmar vid 95 °C och filtrerades genom Whatman nummer 2-filterpapper (Whatman International, Kent, England). Extraktet koncentrerades med hjälp av en rotationsförångare och frystorkades under vakuum. Avkastningen av AME var 37,7 %. För analys med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) löstes 0,4 g AME i 10 ml vatten och sonicerades i 5 minuter vid 25 °C. Extraktet tillsattes till etylacetat, skakades för att blandas och fick stå i 1 minut. Det övre skiktet av etylacetat överfördes och detta förfarande upprepades tre gånger. Det sista etylacetatskiktet koncentrerades och frystorkades.

2.2. HPLC

Proverna analyserades med ett HPLC-system med omvänd fas (Shimadzu 20A, Kyoto, Japan) som bestod av en autosampler (SIL-20A), en binär pump (LC-20AD) och en fotodiode array-detektor (SPD-20A) och var utrustad med en YMC-Triart C18-kolonn (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japan). Gradientflödena för systemet med två lösningsmedel (lösningsmedel A, 0,05 % fosforsyra i vatten; lösningsmedel B, acetonitril) var följande: 85 % A/15 % B vid 0 min, 85 % A/15 % B vid 5 min, 50 % A/50 % B vid 15 min, 50 % A/50 % B vid 20 min, 40 % A/60 % B vid 25 min, 40 % A/60 % B vid 30 min, 15 % A/85 % vid 35 min, 15 % A/85 % vid 40 min, 85 % A/15 % vid 42 min och 85 % A/15 % vid 45 min. Flödeshastigheten för den rörliga fasen var 1,0 ml/min med en injektionsvolym på 10 μl. Detektion utfördes vid 220 nm för atraktylenolid III (Sigma, St. Louis, MO, USA) eller vid 280 nm för atraktylenolid I (Sigma).

2.3. Djur

Sju veckor gamla manliga Balb/c-möss erhölls från SamTaco (Osan, Sydkorea) och hölls i en temperatur- och luftfuktighetskontrollerad patogenfri djuranläggning med en ljus-mörkercykel på 12 timmar. Alla djur genomgick en veckas anpassning före experimenten. Doserna bestämdes med hjälp av en beräkning som extrapolerades från skillnaden i kroppsytan mellan en mus och en människa. Den rekommenderade dosen av AM för en 60 kg tung vuxen människa är 8-24 g rå växt per dag eller 3-9 g extrakt per dag (baserat på extraktionsresultatet i denna studie). Dosen för mus kan bestämmas på följande sätt: en ekvivalent dos för människa på 50-150 mg/kg × 12,3 (omvandlingskoefficienten) = en dos för mus på 615-1 845 mg/kg. Baserat på detta dosintervall valde vi doser på 500 mg/kg och 2 500 mg/kg för den här studien. Djuren fördelades slumpmässigt i försöksgrupper. AME gavs via oral gavage en gång dagligen under 10 dagar. Det fanns inga skillnader i kroppsvikt mellan grupperna under försöksperioden. Djurprotokollet godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012), och mössen sköttes enligt US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) specifikationer.

2.4. Makrofagberedning

För makrofagisolering injicerades möss intraperitonealt med 2 ml 3,5 % sterilt tioglykollat (BD, Sparks, MD, USA) 4 dagar före avlivning. I slutet av försöket offrades mössen genom cervikal dislokation och peritoneala exudatceller isolerades aseptiskt genom peritonealsköljning med kallt DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) som innehöll 10 % serum från fetalt nötkreatur (FBS; Hyclone) och 1 % penicillin-streptomycin. Efter centrifugering resuspenderades cellerna och räknades med hjälp av en TC20 cellräknare (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.5. Beredning av splenocyter

För isolering av splenocyter togs mjälten fram aseptiskt i slutet av försöket. Efter att ha sönderdelat mjälten mellan glasobjektsglas i RPMI 1640 (Hyclone) med 1 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin filtrerades cellerna genom en 70-μm cellsilter. Efter centrifugering lyserades de röda blodkropparna med hjälp av BD PharmLyse lyseringsbuffert (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Cellerna resuspenderades i RPMI 1640 med 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin och räknades med hjälp av en T20 Cell Counter.

2.6. Intraperitoneal injektion av LPS

Möss injicerades intraperitonealt med 1,3 mg/kg LPS (serotyp 055:B5, Sigma) i slutet av experimentet. Efter 1 timme sövdes mössen med eter och blodet samlades upp genom hjärtpunktion. Serum erhölls och förvarades vid -20 °C fram till analys.

2.7. Cellodling

Peritoneala exudatceller plattades ut i 6-hålsplattor eller 60 mm tallrikar och inkuberades över natten vid 37 °C. Efter avlägsnande av icke-adhärenta celler stimulerades fastsatta celler med 100 ng/ml LPS i 24 timmar. Supernatanten och cellerna samlades upp för efterföljande analyser. Splenocyter pläterades i 24-hålsplattor och stimulerades med 2 μg/ml anti-CD3-antikropp (BD Biosciences) i 48 timmar. Supernatanten samlades upp för cytokinanalys.

2.8. Flödescytometri

Cellerna tvättades två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och resuspenderades vid 1 × 106 celler/ml i FACS-buffert (PBS/0,1 % NaN3/1 % FBS). Cellerna blockerades med råttantikropp mot mus CD16/CD32 (BD Biosciences) vid 4 °C i 5 minuter och färgades sedan med fluoresceinkonjugerad antikropp mot mus SR-AI, PE-konjugerad antikropp mot mus LOX1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PE-konjugerad antikropp mot mus CD36, FITC-konjugerad CD11b, PE-konjugerad anti-CD11b, PE-konjugerad anti-mus CD86, FITC-konjugerad anti-mus CD4, PE-konjugerad anti-mus CD8a, FITC-konjugerad anti-mus CD19 och FITC-konjugerad anti-mus IA/IE (BD Biosciences) (alla antikroppar späddes med 1:100) i 30 minuter på is i mörker. Matchade isotypantikroppar användes för att visa ospecifik bindning. Cellerna tvättades och återuppsattes i FACS-buffert. Totalt 10 000 händelser registrerades på en Navios flödescytometer (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA), och data bearbetades med Kaluza-programvaran (Beckman Coulter).

2.9. Cytokinanalys

Nivåerna av TNF-α, IL-6, IFN-γ och IL-4 i supernatanter och serum bestämdes med hjälp av BD OptEIA mouse ELISA-satser (BD Biosciences) enligt tillverkarens protokoll.

2.10. Proliferationsanalys

Splenocyter (4 × 105) i 96-hålsplattor stimulerades med lösligt anti-CD3 mAb (2 μg/ml) i 48 timmar. Cellproliferationen bestämdes med hjälp av CellTiter96 One Solution Cell Proliferation assay-kitet (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. RNA-isolering och realtids-PCR

Total RNA isolerades med hjälp av FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), och cDNA transkriberades omvänt med hjälp av ett High Capacity RNA-to-cDNA-kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Utspätt cDNA blandades med Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) och 2 pmol primers specifika för iNOS, COX2 eller GAPDH. Amplifiering av cDNA utfördes med hjälp av ett StepOnePlus realtids-PCR-system (Applied Biosystems). Efter inledande värmedenaturering vid 95 °C i 10 minuter ställdes PCR-förhållandena in på 95 °C i 15 sekunder och 60 °C i 1 minut i 40 cykler. För varje PCR inkluderades ett motsvarande mRNA-prov utan omvänd transkription som en negativ kontroll. Kvantifiering av antalet kopior av cDNA uppnåddes med hjälp av en standardkurva.

2.12. Statistisk analys

Data presenterades som medelvärde, standardfel för medelvärdet (SEM). Tvåsidigt Student’s t-test eller tvåvägs variansanalys tillämpades för att jämföra skillnader mellan grupper. Om den statistiska analysen visade att skillnaderna mellan flera grupper var signifikanta användes Tukey post hoc-testet för ytterligare jämförelser. Alla statistiska analyser utfördes med programvaran IBM SPSS 22.0 version (IBM, Chicago, IL, USA). P-värden under 0,05 ansågs vara signifikanta.

3. Resultat

3.1. Innehållet av atraktylenolid I och atraktylenolid III i AME

Av de kända kvalitetskontrollmarkörerna är atraktylenolid I och atraktylenolid III verifierade antiinflammatoriska föreningar in vitro . Etylacetatfraktionen från AME identifierades preliminärt med hjälp av en spikad inmatning av autentiska standarder med jämförelse av retentionstider och UV-visionella spektralmönster. HPLC-kromatogrammen visas i figur 1. Innehållet av atraktylenolid I och atraktylenolid III i AME var 0,0338 mg/g extrakt respektive 0,565 mg/g extrakt.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Effekten av oral administrering av AME på Scavenger Receptor Expression in Mouse Peritoneal Exudate Cells

Intraperitoneal injektion av tioglykollat används vanligen för att inducera steril peritonit och anrika peritoneala makrofager från möss i laboratorier . Majoriteten av peritoneala makrofager härstammar från blodmonocyter . Vi samlade in peritoneala exudatceller från AME-behandlade möss med denna metod. CD11b användes som markör för makrofager. Scavengerreceptorer som SRA, CD36 och LOX-1 uppregleras under differentiering från monocyter till makrofager ; därför undersökte vi uttrycket av dessa proteiner. SRA, CD36 och LOX-1 uttrycktes nästan uteslutande i CD11b(+)-celler (figurerna 2(a)-2(c)). Procentandelen SRA(+)CD11b(+)-celler i kontrollgruppen var 66 %, och behandling med 500 mg/kg och 2 500 mg/kg AME ökade signifikant denna population till 69 % respektive 76 %. Frekvenserna av CD36(+)CD11b(+)- och LOX-1(+)CD11b(+)-cellpopulationer i kontrollgruppen var 95 % respektive 14 %, och AME inducerade inga signifikanta förändringar i båda populationerna. Ökningen av SRA(+)CD11b(+)-cellpopulationen tyder på att AME kan stimulera differentieringen av blodmonocyter till makrofager som svar på tioglykollat.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

3,3. Effekt av oral administrering av AME på yt-CD86-uttryck i LPS-stimulerade makrofager

Kostimulerande molekyler som CD86 på makrofager krävs för att stärka samspelet mellan makrofager och Th-celler . Peritoneala makrofager isolerade från AME-behandlade möss stimulerades med LPS i 24 timmar och membranuttrycket av CD86 mättes med hjälp av flödescytometri. Stimulering med LPS ökade den genomsnittliga fluorescensintensiteten för CD86 från 5,24 till 11,24 (figur 3). Den genomsnittliga fluorescensintensiteten för CD86 i grupperna med 500 och 2 500 mg/kg minskade signifikant till 10,14 respektive 10,59. Dessa resultat tyder på att AME kan påverka interaktionen mellan makrofager och Th-celler.

(a)

(b)

(a)
(b)

3,4. Effekter av oral administrering av AME på det inflammatoriska cytokinsvaret i makrofager och serum

Vi undersökte först om oral administrering av AME påverkar det inflammatoriska svaret hos makrofager. Peritoneala makrofager från kontrollgruppen eller AME-gruppen med hög dos stimulerades med LPS i 24 timmar och produktionen av TNF-α och IL-6 i supernatanten mättes. Det fanns ingen skillnad i nivån av TNF-α-sekretion mellan kontroll- och AME-grupperna, men nivån av IL-6 ökade i AME-gruppen (figur 4(a)). Vi fann också att AME inte inducerade några förändringar i genuttrycket av iNOS och COX-2 i celler som stimulerades med LPS (figur 4(b)). Därefter undersökte vi det systemiska svaret hos AME-behandlade möss på intraperitoneal LPS-stimulering. AME minskade serumnivåerna av TNF-α och IL-6 med 20 % respektive 47 % (figur 5). Dessa resultat tyder på att den antiinflammatoriska aktiviteten hos AME kan uppstå oberoende av moduleringen av makrofager.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figur 4

Effekt av AME på inflammatoriska cytokiner och enzymer i LPS-stimulerade makrofager. Makrofager isolerade från kontroll- eller AME-gruppen (2500 mg/kg) stimulerades med LPS (100 ng/ml) i 24 h. (a) Nivåerna av tumörnekrosfaktor- (TNF-) α och interleukin- (IL-) 6 i supernatanten bestämdes med ELISA. (b) Kvantitativ PCR användes för att mäta uttrycket av generna iNOS och COX-2. Målgenuttrycket normaliserades till GAPDH-uttrycket. Data representerar medelvärde ± SEM (n=6). (-): utan LPS, (+): LPS-behandling. # P<0,005 jämfört med kontroll (-), P<0,05 jämfört med kontroll (+).

3,5. Effekter av oral administrering av AME på populationer av T-celler och B-celler i mjälten och MHC II-uttryck

För att avgöra om oral administrering av AME förändrar adaptiva immunceller analyserade vi procentandelarna av CD4- och CD8-T-celler och B-celler i mjälten i kontroll- och AME-grupperna. CD4(+) T-cellspopulationen ökade signifikant från 23,4 % till 27,2 % och 26,9 % i grupperna med 500 respektive 2 500 mg/kg (figur 6(a) och 6(d)). Inga skillnader observerades i populationerna av CD8 T-celler och B-celler (figurerna 6(a), 6(b) och 6(d)). MHC-klass II-molekyler krävs för att antigener ska kunna presenteras för CD4 T-celler. Vi analyserade mjälteuttrycket av musens MHC-klass II-molekyler IA/IE och fann att den genomsnittliga fluorescensintensiteten för MHC II-molekylerna ökade signifikant från 65,3 till 68,9 i AME-gruppen på 2 500 mg/kg (figurerna 6(c) och 6(e)). Dessa resultat tyder på att AME inducerar förändringar i det adaptiva immunsystemet.

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figur 6

Effekter av oral administrering av AME på sammansättningen av det adaptiva immunsystemet i mjälten. Splenocyter isolerades från kontroll- eller AME-grupper och dubbelfärgades med FITC-konjugerad anti-CD4-antikropp och PE-konjugerad anti-CD8-antikropp (a), FITC-konjugerad anti-CD19-antikropp (b) eller FITC-konjugerad anti-MHC II-antikropp (c) och utvärderades med flödescytometri. (a-c) Representativa dot blots eller histogram visas. (d-e) Staplarna representerar medelvärde±SEM (n=6). P <0,001 jämfört med kontroll.

3,6. Effekter av oral administrering av AME på T-cellproliferation och Th1/Th2-cytokinsvar i mjältceller

Vi undersökte funktionen hos T-celler i mjälte efter AME-behandling. Splenocyter isolerade från kontroll- eller AME-grupper stimulerades med anti-CD3-antikropp, ett mitogen som aktiverar hela populationen av T-celler oberoende av antigenreceptorspecificitet. Behandling med anti-CD3-antikropp i 48 timmar ökade den optiska densiteten 2,6 gånger enligt MTS-analysen. Det fanns ingen skillnad i den proliferation som inducerades av anti-CD3-antikroppen mellan kontroll- och AME-grupperna (figur 7 a)). IFN-γ och IL-4 är representativa cytokiner för Th1- respektive Th2-celler. Vi utvärderade utsöndringen av IFN-γ och IL-4 i splenocyter som stimulerats med anti-CD3-antikropp. En signifikant minskning av IFN-γ-sekretionen observerades i 500 mg/kg AME-gruppen, medan IL-4-sekretionen ökade signifikant i 2 500 mg/kg-gruppen (figur 7(b)). Även om ingen dosberoende effekt observerades tenderade AME att främja Th2-svaret.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Diskussion

I traditionell kinesisk medicin förväntas qi-förstärkande örter stärka immunförsvaret. I den här studien fokuserade vi specifikt på de inflammatoriska reaktionerna hos makrofager och T-celler isolerade från möss som fick AME oralt.

Thioglycollatinducerad steril peritonit introducerades för första gången 1964 av Gallily et al. och har sedan dess varit den vanligaste metoden för isolering av primära makrofager . Dag 4 efter intraperitoneal injektion av tioglykollat ökar det totala antalet celler i peritoneal exsudat ungefär 5 gånger . Bland dessa celler är makrofager den dominerande celltypen, följt av eosinofiler . Källan till det ökade antalet peritoneala makrofager hos möss som injicerats med tioglykollat är blodmonocyter från benmärgen . Uppreglering av scavengerreceptorer sker under differentieringsprocessen från monocyter till makrofager . Scavengerreceptorer, som är en typ av medfödda receptorer hos makrofager, är ansvariga för fagocytos och känner specifikt igen polyanjoniska ligander . Vi använde CD11b och flera scavengerreceptormarkörer för att identifiera monocytderiverade makrofager i peritoneala exudatceller och fann att CD11b(+)SRA(+)-cellpopulationen var signifikant ökad i AME-gruppen. Detta tyder på att administrering av AME främjar rekrytering och differentiering av blodmonocyter till makrofager som svar på tioglykollat.

LPS känns igen av toll-like receptor (TLR)-4/MD-2-komplexet. TLR4 inducerar inflammatoriska reaktioner genom två adaptormolekyler, MyD88 och TRIF . Den MyD88-beroende signalvägen aktiverar NF-κB och mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) för att inducera inflammatoriska gener som TNF-α och IL-6 . Den TRIF-beroende signalvägen aktiverar interferonreglerande faktor 3 för att producera IFN-β, som krävs för uppreglering av kostimulerande molekyler . TRIF-signalvägen deltar också i aktiveringen av NF-κB och MAPK, men på ett fördröjt sätt jämfört med den MyD88-beroende vägen . Uppregleringen av kostimulerande molekyler är enbart TRIF-beroende medan inflammatoriska reaktioner är samberoende av MyD88 och TRIF . Det fanns ingen hämmande effekt på de inflammatoriska markörer som testades i makrofager från AME-gruppen. I stället minskade uttrycket av CD86. CD86 på makrofager binder CD28 på Th-celler för att stärka Th-cellernas aktivitet . Våra resultat tyder på att oral administrering av AME inte påverkar NF-κB- och MAPK-beroende inflammatoriska reaktioner i makrofager utan stör specifikt den TRIF-beroende vägen som endast leder till CD86-uttryck. Ytterligare studier behövs för att utvärdera om AME orsakar förändringar i en patologisk situation där makrofager och Th-celler dominerar.

Det LPS-stimulerade makrofagsystemet är en mycket vanlig in vitro-modell för att utvärdera den antiinflammatoriska aktiviteten hos naturprodukter eller läkemedelskandidater. Med hjälp av denna modell är det lätt att uppnå önskat resultat med lipidlösliga komponenter eftersom de lätt kan tränga igenom cellmembranet. Våra data visade att peritoneala makrofager isolerade från möss som fick AME oralt inte visade antiinflammatoriska effekter ex vivo, vilket motsäger tidigare rapporterade in vitro-resultat . Däremot observerades antiinflammatorisk aktivitet av AME i serumresponsen av TNF-α och IL-6 vid intraperitoneal injektion av LPS. Denna systemiska antiinflammatoriska aktivitet är minst troligt att den förmedlas genom modulering av makrofager. En av skillnaderna mellan förhållandena in vivo och in vitro är att LPS transporteras i cirkulationen av flera lipoproteiner och sedan elimineras av hepatocyter in vivo, medan denna händelse inte kan efterliknas in vitro . LPS-clearance kan förhindra överstimulering av leverns makrofager . Huruvida AME:s systemiska antiinflammatoriska aktivitet är relaterad till LPS-clearance i levern återstår att fastställa. Ett liknande resultat erhölls i peritoneala makrofager som isolerats från möss som fått oralt vattenextrakt av Astragalus membranaceus (opublicerade uppgifter). Astragalus membranaceus och AM tillhör samma kategori av Qi-tonifierande örter. För närvarande vet vi inte om antiinflammatorisk aktivitet in vivo som inte involverar makrofagmodulering är unik för dessa medicinalväxter eller om det är en gemensam egenskap som kan induceras av Qi-tonifierande medicinalväxter, och vi måste samla mer data för att kunna dra några slutsatser. Dessutom rapporterade Li et al. att atractylenolid I och 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, en typ av polyacetylenförening som isolerats från AM, har en molekylär struktur som interagerar med membranbunden glukokortikoidreceptor . Enligt deras studie var 300 mg/kg oralt atraktylenolid I och 30 mg/kg oralt polyacetylen de lägsta doser som krävdes för att visa antiinflammatoriska effekter . Mängden atraktylenolid I i 2 500 mg/kg AME är endast 0,097 mg/kg, vilket är en dos som ligger långt under den lägsta dos som krävs. Dessutom måste det ha skett en förlust av polyacetylener under beredningen av AME. Det är möjligt att AME innehåller oidentifierade glukokortikoidliknande föreningar som bidrar till dess systemiska antiinflammatoriska aktivitet.

Ett tillräckligt antal T-celler krävs för att upprätthålla ett korrekt immunförsvar. Under normala förhållanden upprätthålls det totala antalet T-celler genom generering av naiva T-celler i thymus och omsättning av perifera naiva T-celler och minnes-T-celler. Möss och människor genomgår en atrofi av thymus med åldern och följaktligen minskar produktionen av naiva T-celler hos båda arterna. När det gäller underhåll av naiva T-celler producerar möss dock naiva T-celler under sin livstid, medan vuxna människor upprätthåller denna population genom delning av perifera naiva T-celler . Livslängden för musens naiva T-celler är dessutom 40 gånger kortare än för människans motsvarigheter . Minnes-T-celler upprätthålls genom intermittent delning . Den exakta mekanismen för överlevnad och homeostatisk proliferation av naiva T-celler och minnes T-celler är inte helt definierad, men inbegriper signaler från TCR/MHC-komplexet och cytokiner som IL-7 och IL-15 . Den långvariga effekten av vacciner är beroende av minnes-T-celler, medan behandling av lymfopeniska tillstånd kräver naiva T-celler. Vi fastställde inte om den mjältebaserade CD4 T-cellspopulationen som ökade vid AME-behandling bestod av naiva CD4 T-celler eller minnes-CD4 T-celler. En detaljerad karakterisering av den cellfraktion som svarar på AME kommer att bidra till att specificera vilken situation som är bättre lämpad för tillämpning av AME.

Och noterbart är att samtidig uppreglering av MHC-klass II-molekyler i mjälten förekom i AME-gruppen. MHC-klass II-molekyler är nödvändiga för att tillhandahålla antigener till CD4 T-celler. Vi fann rutinmässigt att majoriteten av MHC klass II-uttryckande celler i mjälten är B-celler och att de återstående cellerna är makrofager och dendritiska celler. Vi klargjorde inte vilka typer av celler som uppvisade uppreglering av MHC-klass II-molekyler efter AME-administrering. Ändå tyder ökningar av både antalet CD4 T-celler och uttrycket av MHC-klass II-molekyler i mjälten på att tillskott av AME bidrar till det systemiska underhållet av CD4 T-celler. IL-4 har under fysiologiska förhållanden till uppgift att förstärka antikroppssvaret genom att främja överlevnad och proliferation av B-celler och ge försvar mot helminthinfektioner . Splenocyter från AME-grupperna uppvisade en ökad IL-4-produktion under aktivering av T-celler ex vivo samtidigt med minskad IFN-γ-produktion. Dessa resultat tyder på att AME under normala förhållanden främjar Th2-svaret. Däremot främjar oral administrering av AM-derivat glykoprotein Th1-svaret samtidigt som Th2-svaret minskas i en allergisk modell . Det är oklart om denna förening representerar hela AM:s aktivitet. Ytterligare studier krävs för att fastställa om AME förhindrar eller förvärrar patologiska Th2-svar.

5. Slutsats

I denna studie observerade vi förändringar i svaren från makrofager och T-celler hos normala möss efter oral administrering av AME. AME ökade den tioglykollatinducerade monocytdifferentieringen i peritoneum och undertryckte LPS-inducerade TNF-α- och IL-6-nivåer i serum. Till skillnad från dessa systemiska antiinflammatoriska effekter var antiinflammatoriska effekter inte uppenbara i makrofager isolerade från AME-gruppen med undantag för förändringar i uttrycket av kostimulerande molekyler. AME påverkade också det adaptiva immunsystemet genom att öka antalet CD4 T-celler och uttrycket av MHC-klass II-molekyler och främja Th2-svaret framför Th1-svaret.

Abkortningar

Datatillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten i denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea som finansieras av utbildningsministeriet (2014R1A1A2055052).