I den här studien har vi undersökt effekten av en akut intravenös volymbelastning på 0.9 % saltlösning, 3 % saltlösning och isotonisk glukosinfusion på u-AQP2 och u-ENaCγ i en randomiserad crossover-studie med friska försökspersoner. Syftet var att utvärdera transportaktiviteten via vattenkanalerna aquaporin 2 och de epiteliala natriumkanalerna i huvudcellerna i den distala delen av nefron.
Under infusionen och under perioden omedelbart efter sker adaptiva fysiologiska förändringar i njurfunktionen och vasoaktiva hormoner. De viktigaste förändringarna i effektvariablerna kan således förväntas inträffa efter infusionen. I den aktuella studien ägnade vi särskild uppmärksamhet åt förändringar i effektvariablerna under den sista perioden efter infusionen (Post infusion 210-240), dvs. 60-90 minuter efter det att infusionen hade upphört. Under denna period ökade u-AQP2 efter hypertonisk och isotonisk salininfusion och minskade efter glukosinfusion. Samtidigt ökade u-ENaCγ efter infusion med hypertonisk koksaltlösning och förblev oförändrad efter isotonisk koksaltlösning och glukosinfusion.
U-AQP2 efter infusion med hypotonisk och isotonisk koksaltlösning och isotonisk glukos
Aquaporin-2 (AQP2) är lokaliserat i de viktigaste cellerna i samlingsröret och uttrycks i det apikala plasmamembranet . Vasopressin (AVP) reglerar AQP2 genom att binda till V2-receptorer i det basolaterala membranet, . Kortvarig exponering för AVP leder till att de intracellulära vesiklarna, som innehåller AQP2, transporteras till det apikala membranet och ökar vattenpermeabiliteten och absorptionen . Långsiktig reglering sker under en period av timmar till dagar och orsakas av AVP-reglerad gentranskription som resulterar i en ökning av AQP2 i hela cellen . Experiment på råttor visade att infusion av dDAVP ökade u-AQP2 . Detta stämmer överens med uppfattningen att ökad leverans av AQP2-kanaler till det apikala membranet resulterar i ökad utsöndring av AQP2 efter stimulering med AVP . Ungefär 3 % av AQP2 i samlingsröret utsöndras i urinen , men de underliggande mekanismerna är okända.
Volymexpansion med 3 % hypertonisk koksaltlösning ökar plasmaosmolariteten bortom tröskeln för de hypotalamiska osmoreceptorerna, vilket utlöser frisättning av AVP och en efterföljande ökning av u-AQP2. Saito et al fann ett signifikant samband mellan urinutsöndring av AQP2 och p-AVP hos friska personer efter infusion av 5 % hypertonisk saltlösning . Pedersen et al fann en positiv korrelation mellan u-AQP2 och p-AVP under 24 timmars vattenbrist och efter infusion av 3 % hypertonisk saltlösning . Tidigare studier på människor har således visat att aktiviteten hos vattenkanalerna AQP2 kan bestämmas genom att mäta u-AQP2 . Överraskande nog fann Baumgartner et al ingen förändring av u-AQP2 efter infusion av 2,5 % NaCl hos friska frivilliga, trots en betydande ökning av både urinens osmolaritet och AVP . Den orala vattenbelastningen var dock 3-4 gånger högre före infusionen jämfört med vår studie. Den stora vattenbelastningen före infusionen kan således ha åsidosatt de stimulerande effekterna av hypertonisk koksaltlösning. Som förväntat visade vår studie att u-AQP2 ökade efter 3 % NaCl med en motsvarande ökning av urinens osmolaritet och en minskning av CH2O. Våra resultat tyder således på en ökad vattenreabsorption via vattenkanalerna aquaporin-2 i de distala tubuli. Före ökningen av u-AQP2 skedde en abrupt ökning av p-osm och p-AVP som inducerades av infusionen av hypertonisk saltlösning. Djurstudier har visat att hypertonicitet kan orsaka en uppreglering av AQP2-uttrycket i det apikala membranet som är jämförbar med den som uppnås med enbart AVP . Det kan inte uteslutas att detta kan spela en aktiv roll för den ökade utsöndringen av u-AQP2. Det mest sannolika är att den ökade vattenreabsorptionen förmedlades av en ökning av p-AVP. U-AQP2 fortsatte att stiga under hela undersökningsdagen, vilket tyder på att AQP2-kanalerna förblev insatta och aktiva i det apikala membranet på grund av åtgärder av förhöjt p-AVP.
Infusion av isotonisk koksaltlösning sänker den fraktionella vatten- och saltreabsorptionen i de proximala tubuli hos djur . I denna studie orsakade infusion med 0,9 % NaCl samma reaktion i u-AQP2, u-osm och CH2O som infusion med 3 % NaCl, om än i mindre utsträckning. Det skedde en liten ökning av p-osm till en maximal nivå på 286 mosmol/kg, vilket motsvarar en ökning på 0,5 %. Denna ökning ligger under osmoreceptorernas tröskelvärde, och vi varken såg eller förväntade oss någon betydande förändring av p-AVP. AVP kan därför inte vara den huvudsakliga regulatorn av AQP2 under 0,9 % NaCl. Troligen är den ökade vattentransporten via AQP2 ett kompensatoriskt fenomen för att motverka en minskning av den renala vattenabsorptionen i de proximala tubulerna, som inträffar efter isotonisk volymexpansion. Mekanismen kan bero på en ökad aktivitet i det natriuretiska peptidsystemet .
Infusion av 5 % glukos orsakar en volymexpansion fördelad över alla vätskefaser i kroppen med endast en mycket liten ökning av plasmavolymen. Detta illustreras i mätningarna av plasmaalbumin, där koncentrationerna vid 240 min var praktiskt taget lika stora som vid baslinjen (tabell 4), vilket tyder på att det inte sker någon förändring av den extracellulära vätskan. Enligt vad vi vet har ingen studie mätt u-AQP2 efter glukosinfusion. En studie av friska försökspersoner visade att efter en oral vattenbelastning på 20 ml/kg under 15 minuter (genomsnittligt intag 1605 ml) minskade u-AQP2 med 17 % efter 210 minuter. I en nyligen genomförd studie fick försökspersoner en oral vattenbelastning på 20 ml/kg i 15 minuter (genomsnittligt intag 1389 ml) med en efterföljande minskning av u-AQP2 med 27 % efter 240 minuter . Både plasmaosmolariteten och p-AVP minskade. Det har således visats att u-AQP2 minskar under vattendiuresen efter oralt vattenintag .
I vår studie fick försökspersonerna i genomsnitt 1736 ml glukos intravenöst. Under den sista perioden efter infusionen inträffade det förväntade aquaretiska svaret, med en 16 % minskning av u-AQP2cr, en minskning av u-osm och en ökning av UO och CH2O. Plasmaosmolariteten minskade från 285 mosm/kg till 280 m0sm/kg, dvs. en minskning med 2 %, men utan någon åtföljande minskning av p-AVP. Våra resultat tyder på en minskad reabsorption av vatten via vattenkanalerna aquaporin-2 i de distala tubuli efter isotonisk glukosinfusion. Avsaknaden av förändring i p-AVP kan för det första förklaras av att försökspersonerna hade fått 1225 ml oral vattenbelastning före infusionsstart, och detta kan ha undertryckt AVP i baslinjeperioderna innan. För det andra är det möjligt att mätningarna av p-AVP-koncentrationen inte är tillräckligt känsliga för att upptäcka en liten minskning. Den nyligen upptäckta peptiden Apelin kan också spela en roll. Apelin kolozaliseras med AVP i magnocellulära neuroner i hypotalamus . Hos friska manliga frivilliga försökspersoner minskade plasmaosmolariteten genom vattenbelastning p-AVP blygsamt, men p-Apelin ökade snabbt. Regleringen av Apelin är motsatt den av AVP och data tyder på att Apelin, liksom AVP, kan delta i regleringen av vattenhomeostasen . Vi mätte inte p-Apelin, men det kunde ha varit av intresse att undersöka plasmaapelin parallellt med p-AVP under förhållanden med olika volymexpansioner.
Sålunda ökade u-AQP2 under den sista perioden efter infusionen i ungefär samma utsträckning efter hypertonisk och isotonisk saltvatteninfusion, medan ett markant fall sågs efter isotonisk glukosinfusion. En möjlig förklaring till den fördröjda förändringen av u-AQP2 kan vara att det tar några minuter för förändringar i AVP att verka på huvudcellen, antingen genom insättning eller avlägsnande av AQP2 från det apikala membranet, men att det tar flera minuter innan effekten syns i utsöndringen av u-AQP2 i urinen.
U-ENaCγ efter infusion med hypotonisk och isotonisk saltlösning och isotonisk glukos
Natriumtransport genom samlingsröret sker genom den epiteliala natriumkanalen och är ansvarig för reabsorption av 3-5 % av filtrerat natrium . ENaC består av tre olika underenheter: α, β och γ och lokaliseras vid huvudcellernas apikala plasmamembran . ENaC är en måltavla för aldosteron som verkar på mineralokortikoidreceptorn. Aldosteron ökar natriumtransporten genom att omfördela ENaC-underenheter från intracellulära platser till det apikala membranet samt genom att förändra gentranskriptionen . Även om aldosteronets verkan sker under flera timmar eller dagar, finns det en annan synergistisk väg som involverar AVP . I de kortikala samlingsgångarna hos råttor binder AVP till V2-receptorerna, stimulerar cAMP och ökar natriumreabsorptionen genom att främja trafikering och insättning av ENaC i det apikala membranet, vilket leder till en snabb förändring av kanalaktiviteten . Nya studier på människor visade att AVP, via V2-receptorer, stimulerar ENaC-medierad natriumreabsorption över huvudceller .
Fraktioner av ENaC utsöndras normalt i urinen. Mängden ENaC-fraktioner antas återspegla aktiviteten i natriumtransporten via de epiteliala natriumkanalerna på samma sätt som u-AQP2 återspeglar funktionsstatusen hos vattenkanalerna AQP2. Nyligen introducerade vår grupp en ny metod för att utvärdera natriumreabsorptionen i huvudcellerna i de distala tubuli. Lauridsen et al visade en signifikant korrelation mellan förändringar i urinernas natriumutsöndring och förändringar i urinernas utsöndring av betafraktionen (u-ENaCβ) hos friska människor . U-ENaCβ kan tydligen användas som en biomarkör för transport av natrium via ENaC. I denna studie mätte vi gammafraktionen av proteinet i de epiteliala natriumkanalerna för att utvärdera upp- och nedregleringen av γ-ENaC-uttrycket och natriumtransporten via ENaC som tidigare rapporterats från vår grupp .
Natrium-klorid-symportören (NCC) i de distala konvoluterade tubulerna (DCT) är som en annan viktig natriumreabsorberingsväg. Natriumreabsorptionen i DCT är viktig för att definiera mängden natriumleverans till de viktigaste cellerna i samlingsledaren. Det är allmänt accepterat att NCC regleras av Ang II och aldosteron . Studier har också visat att högt AVP ökar fosforyleringen av NCC och förmodligen resulterar i större natriumreabsorption .
Experimentella djurstudier har visat att isotonisk och hypertonisk koksaltlösning IV minskar reabsorptionen av natrium i de proximala tubuli och därmed ökar mängden natrium i urinen . Andersen LJ et al studerade effekterna av hypertonisk och isotonisk saltlösning hos friska försökspersoner som fick en kontrollerad diet. Försökspersonerna fick en intravenös natriumbelastning av antingen 25 ml/kg isotonisk koksaltlösning eller 4,5 ml/kg 3 % hypertonisk koksaltlösning i 90 minuter. Urinutskiljningen av natrium ökade i både isotonisk och hypertonisk saltlösning, och natriuresen efter hypertonisk saltlösning var större än efter isotonisk saltlösning. Plasmanatrium och plasmaosmolariteten ökade avsevärt efter hypertonisk saltlösning, liksom p-AVP. Vår studie visade att 3 % NaCl-infusion ökade u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na och p-AVP. Våra resultat återspeglar således en ökad natriumreabsorption via ENaC i huvudcellerna och bekräftar dessutom resultaten från Andersen et al . Den ökade u-ENaCγ skulle delvis kunna förklaras av en betydande minskning av den renala natriumabsorptionen proximalt i nefronet, som kompenseras och justeras av en ökad absorption i den distala delen. Den ökning av p-AVP som sågs omedelbart efter infusion av 3 % NaCl skulle dock också kunna tyda på att den ökade u-ENaCγ orsakas av åtgärder från AVP. En ökad natriumförflyttning från lumen till cellen via ENaC skulle teoretiskt sett driva på kaliumsekretionen genom ROMK-kanalerna . Överraskande nog uppmätte vi en nedgång i utsöndringen av kalium i urinen. Detta skulle kunna tala emot en viktig roll för ENaC-medierad natriumtransport. Om NCC ökade natriumreabsorptionen, både för att kompensera för en minskad proximal reabsorption och på grund av hög p-AVP, skulle mindre natrium transporteras av ENaC och därmed skulle kaliumsekretion inte äga rum. En eventuell roll för NCC efter infusion med hypertonisk saltlösning är rent spekulativ eftersom vi inte mätte NCC:s aktivitet. Kanske såg vi inte den positiva effekten på kaliumsekretionen inom våra tidsgränser. Kaliumtransporten är dock komplex och faktorerna som modulerar kaliumtransporten, t.ex. förändrat tubulärt flöde och aldosteron, är många.
Efter volymexpansion med isotonisk koksaltlösning sänks det onkotiska trycket något, vilket leder till en omedelbar ökning av GFR och mindre reabsorption av vatten i den proximala tubuli. Vi uppmätte en liten ökning av GFR och UO-produktion. Natriumutsöndringen ökade, men u-ENaCγ, p-Na, p-osm och p-AVP förblev oförändrade, så fynden var som vi förväntade oss. När det gäller NCC skulle man inte förvänta sig någon förändring av den NCC-medierade natriumreabsorptionen under isotonisk saltlösning.
Ingen studie har någonsin utvärderat u-ENaCγ under vattendiures. I vår studie uppmätte vi en trend mot en minskning av u-ENaCγ efter glukosinfusion, vilket återspeglar en liten minskning av natriumreabsorptionen via ENaC i huvudcellen. Som tidigare nämnts uppmätte vi en 2-procentig minskning av p-osmolalitet efter glukosinfusion, vilket teoretiskt sett borde utlösa en minskning av AVP. Vi upptäckte inget fall i p-AVP, vilket förmodligen berodde på ett lågt p-AVP orsakat av oral vattenbelastning i förväg eller på att mätningarna av p-AVP-koncentrationen kanske inte är tillräckligt känsliga för att upptäcka små förändringar. Man skulle kunna anta att minskningen av u-ENaCγ kan bero på bristande AVP-bindning till V2-receptorer i huvudcellens basolaterala membran. Brist på AVP-stimuli leder till en ökad endocytos av ENaC-kanaler från membranytan till återvinningsvesiklar, vilket minskar reabsorptionen av natrium .
Sålunda ökade u-ENaCγ under den sista perioden efter infusionen markant efter infusion av hypertonisk koksaltlösning, var ungefär på samma nivå efter isotonisk koksaltlösning och minskade eller hade en tendens att minska som svar på glukosinfusion. Ökningen av p-osm och p-AVP sågs omedelbart efter det att infusionen av 3 % NaCl upphörde. Fördröjningen och den konstanta nivån av u-ENaCγ efter hypertonisk koksaltlösning kan förklaras av att det tar några minuter att öka trafiken av intracellulära depåer av ENaC-kanaler till det apikala membranet, men flera minuter att utsöndra ENaC i urinen efter stimulering med AVP.
Vasoaktiva hormoner
Förutom AVP är renin-angiotensin-aldosteronsystemet (RAAS) en viktig regulator av den renala natriumutsöndringen och därmed av kroppsvätskans volym. Det är väl känt att natriumdepletion aktiverar och att kronisk natriumbelastning minskar RAAS . Studier in vitro och in vivo har visat att aldosteron stimulerar mineralokortikoidreceptorn till en ökad transkription av gener som kodar för proteiner som är involverade i natriumtransport, dvs. ENaC och Na,K-ATPas .
Antaliga studier av förändringar i blodvolym har visat att akuta förändringar är förknippade med inversa justeringar av renin-angiotensin-aldosteronsystemet . I denna studie resulterade volymexpansion med 3 % och 0,9 % saltlösning i en liknande och signifikant minskning av PRC, p-AngII och Aldo, vilket överensstämmer med en ökning av den extracellulära volymen. Detta stämmer överens med tidigare studier .
Efter glukosinfusion uppmätte vi ingen signifikant förändring av PRC, p-AngII eller p-Aldo. Detta var förväntat eftersom glukosinfusion inte orsakar någon markant förändring av den extracellulära volymen. Vår studie var inte utformad för att möjliggöra eventuella reglerande effekter av aldosteron eftersom aldosteronets verkan sker över timmar eller dagar. Därför måste andra faktorer vara inblandade i regleringen av ENaC.
Styrkor och begränsningar
Den största styrkan i denna studie var utformningen som en randomiserad crossover-studie med en homogen grupp friska unga män och kvinnor. Testvillkoren var mycket väldefinierade när det gäller kost, natrium- och vätskeintag. Resultaten är således inte förväxlade med olika salt- eller vattenbalans. I denna studie undersöktes endast de akuta effekterna av volymexpansion. Utan tvekan hade vi kunnat få mer information om de långsiktiga effekterna av volymexpansion och urinutsöndringen av AQP2 och ENaCγ om perioden efter infusionen hade varit längre. Dessutom var studien inte placebokontrollerad, genom infusion med en försumbar mängd 0,9 % saltlösning. Detta hade kunnat skilja effekterna av volymexpansion från den övergripande variabiliteten i vatten- och saltreabsorptionen. I denna studie var det inte möjligt att utföra ANP-mätningar. Det kunde ha bidragit positivt till våra resultat.