Resultat
Effektiv biotinylering av märkt GATA-1 i transfekterade celler. Schemat för specifik biotinylering in vivo av märkta proteiner i däggdjursceller beskrivs i figur 1A. Enligt detta förfarande fusioneras en liten (23 aa) peptidtagg med det aktuella proteinet och samexpresseras i celler tillsammans med BirA, ett bakteriellt protein-biotinligas (20). Den peptidtagg som används har tidigare isolerats från ett syntetiskt peptidbibliotek som undersökts för BirA-medierad biotinylering, som sker specifikt vid lysinresterna i taggen (16). Sökningar i proteindatabaser har inte identifierat några naturligt förekommande proteiner som har ett sekvensmotiv som liknar peptidtaggens.
(A) Schema för specifik biotinylering av märkt GATA-1 med BirA biotinligas i MEL-celler. Sekvensen för den 23-aa peptidtaggen som är fusionerad med GATA-1:s N-terminus visas. Asterisken anger den lysinrest som blir specifikt biotinylerad av BirA. De prickiga rutorna visar positionerna för GATA-1:s två zinkfingrar. GATA-1 och BirA klonades separat i en däggdjurs erytroida uttryckskassett och samexpressades i MEL-celler. (B) Biotinylering av märkt GATA-1 i MEL-celler. (Vänster) Western blot med en anti-GATA-1-antikropp för att upptäcka endogena och taggade GATA-1-proteiner. (Höger) Western blot av samma extrakt med streptavidin-HRP-konjugat för att upptäcka biotinylerat GATA-1. Kärnextrakt (5 μg per körfält) från dubbla transfektanter (körfält 1 och 5) och enkla transfektanter (körfält 2, 3, 6 och 7) för märkt GATA-1 och Bir A testades. Lane 4 och 8, kärnextrakt från icke transfekterade MEL-celler. Biotinylerat GATA-1 (asterisk) är tydligt synligt endast i körfältet för de dubbelt transfekterade cellerna. Det anges också den låga bakgrund som detekteras av streptavidin i MEL-kärnextrakt från celler som endast uttrycker BirA (höger, körfält 7). (C) Effektivitet för biotinylering av GATA-1 och bindning till streptavidinpärlor. (Vänster) Western blot med anti-GATA-1-antikropp för att detektera bindning av märkt GATA-1 till streptavidinpärlor (körfält 2; utgångsmaterialet för bindningen var 2,5 gånger den mängd kärnextrakt som visas i inmatningsfältet). Ingångsmaterial och obundet material visas i körfält 1 och 3. (Höger) Samma filter strippat och reprobed med streptavidin-HRP för att detektera bindningen av biotinylerat GATA-1 till streptavidinpärlor (körfält 5). Lane 6 visar att mycket lite märkt GATA-1 förblir obundet av streptavidin. I detta bindningsexperiment tvättades pärlorna under stränga förhållanden (0,5 M NaCl/0,3 % Triton X-100 i PBS). In, input (kärnextrakt); El, eluerat material; Un, obundet material.
Det protein som vi märkte när vi testade detta system var den essentiella hematopoietiska transkriptionsfaktorn GATA-1 från murin (för en översikt, se ref. 25). Taggen fusionerades N-terminalt med GATA-1 och uttrycktes under kontroll av en humant β-globin-expressionskassett i MEL-celler, som kan induceras till att genomgå terminal erytroid celldifferentiering (22). BirA klonades också och uttrycktes i MEL-celler med hjälp av den humana globinuttryckskassetten. Kloner som motsvarar enkla och dubbla stabila transfektanter för märkta GATA-1 och BirA isolerades och undersöktes inledningsvis för uttryck av båda konstruktionerna. När det gäller GATA-1 upptäcker Western blot-analys med hjälp av en GATA-1-antikropp det långsammare vandrande märkta proteinet samt det endogena GATA-1 i kärnextrakt från transfekterade celler (fig. 1B, körfält 1 och 2). Uttrycket av BirA analyserades på RNA-nivå (data visas inte).
Vi testade därefter, på utvalda stabila transfektanter, om det taggade GATA-1-proteinet biotinylerades av BirA. Analys av kärnextrakt från MEL-cellkloner med hjälp av ett streptavidin-HRP-konjugat visade en robust signal som motsvarade det märkta GATA-1-proteinet, som endast kunde detekteras i körfältet för den märkta GATA-1/BirA-dubbeltransfektanten (fig. 1B, körfält 5). Ingen biotinylering av märkt GATA-1 syns i avsaknad av BirA (fig. 1B, körfält 6). Dessa resultat bekräftar att BirA-proteinet syntetiseras i aktiv form i transfekterade MEL-celler. Dessutom observeras mycket lite ospecifik bakgrundsbiotinylering i kärnextrakt från MEL-celler som endast uttrycker BirA (fig. 1B, körfält 7). Vi drar därför slutsatsen att uttryck av bakteriellt BirA-protein-biotinligas i MEL-celler specifikt kan biotinylera en transkriptionsfaktor från däggdjur som bär en unik peptidtagg.
Vi testade därefter biotinyleringens effektivitet genom att binda taggat GATA-1 i råa kärnkraftsextrakt till streptavidin-paramagnetiska Dynabeads (fig. 1C). Analys av det material som eluerades från pärlorna visade att nästan hela det märkta GATA-1-proteinet var bundet (jämför körfält 2 med körfält 1 och 3, fig. 1C). Omprovningen av samma filter med streptavidin-HRP visar ≈100 % effektivitet när det gäller biotinylering och infångning av märkt GATA-1 av pärlorna (fig. 1C, körfält 4 och 5). Dessutom, i överensstämmelse med vad som sågs i figur 1B, finns det liten bakgrundsbindning av endogent biotinylerade proteiner till pärlorna, vilket detekteras med streptavidin-HRP (figur 1C, körfält 5). Dessa data visar att märkt GATA-1 biotinyleras mycket effektivt och återvinns från extrakt genom streptavidinbindning, med försumbar bakgrundsbiotinylering.
Ettstegsrening av biotinylerat GATA-1 från råa kärnextrakt genom streptavidinbindning. Vi undersökte också genomförbarheten av en enkelstegsrening för att isolera biotinylerat GATA-1 från råa kärnextrakt genom att direkt binda till streptavidinpärlor under måttlig stringens (150 mM NaCl/0,3 % Nonidet P-40/200 ng/μl kycklingserumalbumin). Vi försökte först med en kontrollbindning från 5 mg rå kärnextrakt från MEL-celler som endast uttrycker BirA (fig. 2, körfält 4). Det eluerade materialet bestod av ungefär fem starkt färgade band mot en bakgrund av mycket svagare band (fig. 2, körfält 5). Vi identifierade de bakgrundsbindande proteinerna genom att ta ut hela banan från gelen och analysera den med vätskekromatografi-tandem-MS. De proteiner som identifierats på detta sätt klassificeras i tabell 1 enligt biologisk funktion och cellulärt fack, enligt Gene Ontology Consortium (www.geneontology.org). Resultaten visade att de vanligaste bakgrundsproteinerna som identifierades var de naturligt biotinylerade karboxylaserna och associerade enzymerna, som till stor del sammanföll med de intensivt färgade banden. Vi fann också bakgrundsbindning av rikligt förekommande nukleära proteiner som är involverade i mRNA-bearbetning, t.ex. splicingfaktorer, samt av ribosomala proteiner. Tillsammans stod dessa tre klasser av proteiner för >80 % av bakgrundsbindningen under de förhållanden som användes (tabell 1). Det är anmärkningsvärt att mycket få peptider identifierades som motsvarande faktorer som är involverade i transkriptionsreglering (tabell 1). Vi drar slutsatsen att bakgrundsbindning till streptavidinpärlor huvudsakligen beror på endogena biotinylerade proteiner samt rikligt förekommande nukleära faktorer som är involverade i mRNA-bearbetning och ribosomsyntes och -sammansättning, med mycket liten ospecifik bindning av faktorer som är involverade i transkriptionsreglering/aktivering.
Colloidalblåfärgad gel från ett bindningsexperiment av råa kärnextrakt till streptavidinpärlor. Lane 1, markör (M). Lane 2, ingående kärnextrakt från märkta GATA-1/BirA dubbeltransfekterade celler (≈12 μg). Lane 3, proteiner som eluerats efter direktbindning till streptavidinpärlor av ≈5 mg rå kärnextrakt från taggade GATA-1/BirA-transfekterade celler. Lane 4, ingående kärnextrakt från märkta GATA-1/BirA-transfekterade celler. Lane 5, proteiner som eluerats efter bindning till streptavidinpärlor ≈5 mg kärnextrakt från BirA-transfekterade celler. Pilen i fil 3 indikerar proteinband som innehåller renat biotinylerat GATA-1, vilket bestämdes med MS.
- Se inline
- Se popup
Nästan försökte vi binda en liknande mängd rå kärnextrakt (5 mg) från märkta GATA-1/BirA dubbeltransfekterade transfektanter, under samma förhållanden (fig. 2, körfält 2). Färgningsmönstret i körfältet med det eluerade materialet (fig. 2, körfält 3) skilde sig avsevärt från det som observerades med bakgrundsbindningen i körfält 5, vilket tyder på en betydande anrikning av proteiner som sambinds med märkt GATA-1 (fig. 2, körfält 3 jämfört med körfält 5). Biotinylerat GATA-1 och proteiner som är samverkande med andra proteiner kan spädas ut eller konkurrera om bindning med de ospecifika proteiner som observeras i körfält 5. Den proteinberikning som syns i körfält 3 kan därför motsvara samurifierade GATA-1-interagerande proteiner. I det eluerade materialet observerade vi också ett starkt färgat band som migrerar med en storlek som liknar den som förväntas för märkt GATA-1 (fig. 2, pil, körfält 3). Vi bekräftade närvaron av GATA-1 i detta band med hjälp av gelutskärning och MS. Den detaljerade analysen av alla proteiner som sampurifierar med märkt GATA-1 kommer att publiceras på annat håll (P.R., F.G. och J.S., opublicerade resultat). Sammantaget visar dessa data kvantitativ biotinylering av märkt GATA-1 i MEL-celler och dess effektiva rening från råproteinextrakt i ett enstegsförfarande genom direktbindning till streptavidinpärlor, med få bakgrundsbindningsband som främst motsvarar endogent biotinylerade proteiner och lätt identifierbara rikliga nukleära/nucleolära proteiner.
Biotinylering påverkar inte GATA-1:s egenskaper för proteininteraktion eller DNA-bindning. Eftersom det är möjligt att tillägg av peptidtaggen och/eller biotinylering kan påverka egenskaperna hos det taggade proteinet, testade vi om biotinylerad GATA-1 fortfarande kunde genomgå protein-proteininteraktioner med en känd GATA-1-partner, till exempel FOG-1 (26), och om den kunde binda in vivo till kända mål för GATA-1-genen, till exempel mus βmaj-globinpromotorn. Vi utförde ett pull-down-experiment av biotinylerad GATA-1 genom att binda kärnextrakt till streptavidinpärlor och testade om FOG-1 också sampurifierades. Vi fann att FOG-1 drogs ner från extrakt som uttryckte biotinylerad GATA-1 men inte från extrakt som endast uttryckte BirA (Fig. 3A, körfält 2 och 4). Vi har också funnit att FOG-1 samurifieras med biotinylerat GATA-1 genom MS. Vi utförde också ett kromatin pull-down (ChIP)-experiment där sonat kromatin från formaldehyd-korslänkade MEL-celler inkuberades med streptavidinpärlor, följt av eluering av det bundna materialet och återvinning av det pulled-down-dna. Med hjälp av primers som är specifika för βmaj-promotorn fann vi en anrikning för dessa sekvenser i det DNA som drogs ner från kromatinet från celler som uttrycker biotinylerat GATA-1 men inte från celler som uttrycker BirA (fig. 3B). Vi har också funnit att biotinylering inte påverkar den subkärniga fördelning som normalt observeras med GATA-1 (fig. 5, som publiceras som stödinformation på PNAS-webbplatsen; ref. 27) och att biotinylerat GATA-1 uppvisar en identisk biokemisk fraktioneringsprofil som endogent GATA-1 i kärnextrakt från MEL-celler (data inte visad). Sammantaget ger dessa resultat starka bevis för att GATA-1:s egenskaper inte påverkas av biotinyleringsmärkning. Dessutom visar dessa data också att biotinyleringsmärkning kan användas som ett alternativ till antikroppar i metoder som inbegriper ett affinitetsreningssteg, t.ex. protein pull-downs eller ChIP-analyser.
(A) Bindning av biotinylerat GATA-1 till streptavidinpärlor drar specifikt ner FOG-1, vilket detekteras genom Western Blotting med hjälp av en FOG-1-antikropp. Däremot kan FOG-1 inte dras ner av streptavidin i kärnextrakt som uttrycker biotinylerade uttrycker endast BirA (höger). FOG-1 upptäcks som en doublet (26). (B) Streptavidin pull-down av βmaj globinpromotorsekvenser från tvärbundet kromatin från MEL-celler som uttrycker biotinylerat GATA-1 (vänster) eller endast BirA (höger). Trianglarna anger ökande mängder neddraget tvärbundet kromatin som används som mall i PCR-reaktioner för att detektera amplifiering av βmaj-sekvenserna. Specifik anrikning för βmaj-sekvenser observeras i neddraget kromatin från celler som uttrycker biotinylerat GATA-1 men inte från celler som uttrycker endast BirA.
Biotinyleringsmärkning i transgena möss. Förmågan att direkt isolera det biotinmärkta proteinet från råextrakt i ett enda steg ökar möjligheten att använda detta tillvägagångssätt vid rening av märkta proteiner från begränsande källor som t.ex. musvävnader. Vi testade därför om BirA-medierad biotinyleringsmärkning också skulle fungera in vivo i transgena möss. Eftersom överuttryck av GATA-1 leder till embryonal dödlighet hos möss (28) testade vi detta tillvägagångssätt genom att märka den essentiella erytropoetiska transkriptionsfaktorn EKLF (29). Mouse EKLF cDNA märktes med biotinyleringstaggen och en dubbel hemagglutininepitop och mikroinjicerades i musägg för att etablera transgena muslinjer. På samma sätt upprättades transgena muslinjer genom att mikroinjicera BirA/erytroida uttryckskassettkonstruktionen. Transgena muslinjer med påvisbart uttryck av märkt EKLF och BirA i erytroida celler valdes ut och korsades. Biotinylering in vivo av märkt EKLF bedömdes i kärnextrakt som framställts från fosterlevern från 13,5-dagars postcoitumembryon. Western blot-analys med en anti-EKLF-antikropp påvisade endogent EKLF såväl som märkt EKLF, vilket visualiserades som en dubblering (fig. 4, körfält 1). Bindning av extrakt av kärnor från fosterlever till streptavidinpärlor visar att endast det översta bandet i dubbletten bibehålls, vilket tyder på att det är biotinylerat (fig. 4, körfält 2 och 3). Denna observation bekräftas genom att testa samma blot med streptavidin-HRP, som endast upptäcker ett enda band (fig. 4, körfält 7 och 9). Den doublet som upptäcks av EKLF-antikroppen beror sannolikt på det differentiella utnyttjandet av översättningsinitieringskodoner vid den N-terminalt fusionerade biotinyleringstaggen (övre bandet) och vid den dubbla hemagglutininepitopen som finns omedelbart nedströms och som också innehåller ett initieringskodon (nedre bandet). Som ett resultat av detta fungerar endast det översta bandet med biotinyleringstaggen som substrat för BirA, vilket ytterligare visar att detta tillvägagångssätt är specifikt in vivo. Bindningen av kärnextrakt till streptavidinpärlor visade också att en betydande andel (≈50 %) av märkt EKLF biotinyleras i fosterlevern hos transgena möss. Vi spekulerar i att skillnaden i biotinyleringseffektivitet mellan transfekterade celler och fosterlever (bortsett från användningen av olika fusionsproteiner) kan avspegla en in vivo-begränsning i tillgängligheten av biotin (biotin är rikligt förekommande i FCS som används för att komplettera cellodlingsmedier) eller en skillnad i BirA-uttrycksnivåer. Dessa resultat visar att den specifika biotinyleringen av märkt EKLF med bakteriell BirA också kan uppnås med hög effektivitet in vivo i transgena möss.
Specifik biotinylering av märkt EKLF i transgena musembryon. Kärnextrakt från fosterlevern hos 13,5-dagars postcoitum-embryon från en dubbel transgen linje med märkt EKLF/BirA (körfält 1-3 och 7-9) och från en transgen linje med märkt EKLF (körfält 4-6) bands till streptavidinpärlor. Märkt och biotinylerad EKLF i ingående kärnextrakt, obundet material (sup., supernatant) och bundet material detekterades med en EKLF-antikropp (vänster) eller med streptavidin-HRP (höger). EKLF biotinylering och bindning till pärlorna detekteras endast i extrakt från dubbelt transgena embryon.