Det övergripande målet med denna hemagglutinationsinhibitionsanalys är att mäta antikroppstitrar mot specifika virus av intresse. Denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågor inom vaccinationsområdet om vaccinmedierad immunitet och skydd inom olika populationer och i olika ålders- och patientgrupper. De främsta fördelarna med denna teknik är att den är noggrann och att den möjliggör snabb titerbestämning av förekomsten av neutraliserande antikroppar.
Tyvärr kan denna metod ge insikt i antikroppstitrar hos människor, men den kan också tillämpas på andra system, t.ex. antikroppstitrar för serum från möss och även odlingssupernatanter. Börja med att märka mikrotiterplattor med 96 brunnar med lämplig experimentell information. Vänd sedan plattan i vertikal riktning och använd en flerkanalspipett för att tillsätta 25 mikroliter PBS till varje brunn, utom den första brunnen i den nedre bakre titreringsraden.
Sätt 50 mikroliter av den nyberedda antigenlösningen av intresse till den första brunnen i bakre titreringsraden, följt av tillsättandet av 25 mikroliter av RDE-behandlade serumprover till de första brunnarna i de tio översta raderna. Tillsätt 25 mikroliter av lämpligt antiserum till den första brunnen i den elfte raden som en positiv kontroll. Överför 25 mikroliter från den första brunnen i varje rad till de efterföljande brunnarna för att utföra seriella, tvåfaldiga utspädningar.
Pipettera upp och ner 10 till 15 gånger för varje utspädningssteg och kasta de sista 25 mikroliterna från de sista brunnarna. Tillsätt sedan 25 mikroliter av antigenlösningen till varje brunn i raderna ett till 11 och 25 mikroliter av enbart PBS till varje brunn i den bakre titreringsraden. Knacka försiktigt på plattan 10 gånger på alla fyra sidorna för att blanda.
Täck sedan plattan i 30 minuter i rumstemperatur. I slutet av inkuberingen, tillsätt 50 mikroliter lösning av röda blodkroppar till varje brunn och blanda plattan med fler knackningar. Täck sedan plattan igen och inkubera de röda blodkropparna enligt den art som används enligt tabellen.
När de röda blodkropparna har tillsatts till plattan, håll dig till lämplig inkubationstid för den blodtyp som används i analysen. En för kort eller för lång inkubationstid leder till en felaktig tolkning av resultaten. I slutet av inkubationen bedömer du hemagglutinationen genom att luta plattan 90 grader i 25 sekunder och markera resultaten för varje brunn, medan plattan fortfarande är lutad, på ett utskrivet schema av 96-brunnsplattan.
I detta experiment bedömdes det vaccininducerade antikroppssvaret hos 26 friska frivilliga som fick ett inaktiverat, trivalent influensavaccin som innehöll influensa A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 och B/Massachusetts/O2/2012 före influensasäsongen 2015. Ett korsreaktivt immunsvar för A/H3N2/Schweiz/2013 och A/H3N2/Texas/2012-virusstammar observerades, med betydligt lägre geometriska medelvärden för hemagglutinationshämningstiter och inducerad seroprotektion mot influensa A/H3N2/Schweiz/2013 jämfört med influensa A/H3N2/Texas/2012. Efter vaccination ökade antikroppstitrar mot båda stammarna, även om stammen A/H3N2/Schweiz/2013 inte fanns med i vaccinet.
Viralt hemagglutinin visar en artberoende potential för erytrocythemagglutination. Av intresse är att marsvinsblod inte hemagglutinerar ordentligt med influensa B och kalkonblod har potential för hemagglutination med höga titrar och låg korsreaktivitet. När man väl behärskar denna teknik kan den slutföras på tre timmar om den utförs korrekt.
När man försöker sig på detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att serumera med RDE för att inaktivera eventuella ospecifika hämmare och ospecifik bindning under hemagglutinationen av viruset. Efter detta förfarande kan andra metoder som ELISA utföras för att besvara ytterligare frågor om den roll som enskilda patogenspecifika immunglobuliner spelar. Efter utvecklingen banade denna teknik väg för forskare inom området viral immunologi för att öka vår förståelse av vaccinrelaterad immunitet hos friska och immunsupprimerade patienter inom olika åldersgrupper.
När du har tittat på den här videon bör du ha en god förståelse för hur man utför en hemagglutinationsinhibitionsanalys för att kvantifiera influensastamsspecifika antikroppstitrar i stor skala. Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med virala antigener, djurblod och serumprover från människor och att försiktighetsåtgärder som att arbeta i ett BSL2-laboratorium alltid bör vidtas när du utför detta förfarande.