För att demonstrera användningen av Escher-FBA för verkliga tillämpningar presenterar vi fyra viktiga FBA-exempel som kan exekveras direkt i webbläsaren. Dessa är anpassade från en genomgång av FBA och dess tillämpningar . Dessa exempel bygger på standardkärnmodellen för E. coli, så de är redo att genomföras så snart Escher-FBA-webbplatsen öppnas. Se till att klicka på knappen Återställ karta mellan varje exempel. Om du har problem med att hitta en reaktion klickar du helt enkelt på alternativet Hitta i menyn Visa (eller ”f”-tangenten på ditt tangentbord) för att öppna ett sökfält.
FBA med alternativa kolsubstrat
Det första exemplet visar användningen av FBA för att förutsäga om tillväxt kan ske på alternativa kolsubstrat. Standardkärnmodellen för E. coli innehåller ett simulerat minimalt medium med D-glukos som kolkälla. Här kommer vi att byta kolkälla från D-glukos till succinat. För det första, håll musen över succinatutbytesreaktionen EX_succ_e och ändra den nedre gränsen till – 10 mmol/gDW/timme, antingen genom att dra i skjutreglaget eller genom att skriva in – 10 i fältet Lower Bound (nedre gränsen). Därefter går du med musen över D-glukosutbytesreaktionen EX_glc_e och höjer antingen den nedre gränsen till 0 eller klickar på Knockout-knappen. Standardmålet är fortfarande att maximera tillväxten, så dessa två ändringar kommer att instruera programmet att beräkna den maximala tillväxten medan succinat används som kolkälla i stället för D-glukos. Du bör se att den maximala beräknade tillväxten minskar från 0,874 h- 1 till 0,398 h- 1, vilket återspeglar E. coli:s lägre tillväxtavkastning på succinat (fig. 2a). Detta är det allmänna tillvägagångssättet för att göra ändringar i Escher-FBA; musen över reaktionen, gör de nödvändiga ändringarna och Escher-FBA kommer automatiskt att visa dina resultat. De nedre gränsvärdena för utbyte av kolkällor representerar experimentella mätningar, så du kan prova att justera det specifika nedre gränsvärdet till realistiska värden för tillväxt på andra kolkällor.
Exempel på Escher-FBA-simuleringar. (a) Simulerad tillväxt med succinat som enda kolkälla. (b) Simulerad anaerob tillväxt på ett glukosminimalt medium. (c) Maximering av ATP-avkastningen i standardmodellen. (d) Tillväxt i iMM904-modellen av S. cerevisiae. Observera att pilarnas bredd ökades i inställningsmenyn för att göra förändringarna tydligare
FBA under anaerob tillväxt
Anaerob tillväxt kan simuleras på samma sätt genom att föra muspekaren över EX_o2_e-reaktionen och antingen klicka på Knockout eller ändra den nedre gränsen till 0. Om du ändrar syreutbytet till noll medan succinat fortfarande är den enda kolkällan visar indikatorn Flux Through Objective ”Infeasible solution/Dead cell”, vilket innebär att tillväxt inte är möjlig. Prova att klicka på knappen Återställ i det nedre högra hörnet för att simulera ett minimalt medium med D-glukos som kolkälla, slå sedan ut EX_o2_e, och den förutspådda tillväxthastigheten bör vara 0,211 h- 1 (fig. 2b).
FBA med sammansatta mål
Escher-FBA stöder inställning av flera mål i läget Sammansatta mål. I standardmodellen inaktiverar inställningen av ett nytt mål alltid det föregående målet. För att aktivera läget klickar du först på knappen Compound Objectives (sammansatta mål) längst ner på skärmen. Ett exempel på hur läget kan användas: för att kontrollera maximal tillväxthastighet och samtidigt minimera flödet genom SUCDi, börja med standardmålet att maximera biomassaproduktionen. Håll sedan musen över reaktionsetiketten för SUCDi och klicka på knappen Minimera i verktygstipsen. Längst ner till höger bör du se båda målen listade. Observera att endast målkoefficienter på 1 eller – 1 (representerade av Maximize och Minimize) stöds för närvarande. Om du vill gå tillbaka till enskilda mål klickar du bara på knappen Compound Objectives igen.
Analys av metaboliska utbyten
Vi kan också använda Escher-FBA för att bestämma det maximala utbytet av prekursorer och kofaktorer som ATP. Allt som krävs är en stökiometriskt balanserad reaktion som förbrukar den intressanta kofaktorn. Reaktionen för ATP-underhåll (ATPM) är ett sådant exempel. För att bestämma den maximala produktionen av ATP är det bara att föra musen över ATPM-reaktionen och klicka på knappen Maximera. Att ställa in målet på detta sätt fungerar eftersom systemet, för att maximera flödet genom ATPM-reaktionen, först måste producera ATP i högsta möjliga mängd. När ATPM maximeras i standardmodellen för E. coli:s kärnmetabolism är målvärdet 175 mmol/gDW/timme. (fig. 2c). Med succinat som kolkälla minskar detta värde till 82,5 mmol/gDW/hr. Samma förfarande kan följas för alla metaboliter av intresse genom att skapa en stökiometriskt balanserad konsumtionsreaktion och ställa in modellen så att den maximerar flödet genom den reaktionen. Observera att det för närvarande inte är möjligt att skapa en sådan reaktion automatiskt i Escher-FBA, men detta kan läggas till i en framtida version.
Analys av flödesvariabilitet
Analys av alternativa optimala lösningar i metabolismen är en annan användbar tillämpning av FBA . Eftersom de lösningar som produceras genom FBA ofta inte är unika kan det vara användbart att känna till det intervall av flödesvärden som en viss reaktion kan ha. Fluxvariabilitetsanalys (FVA) används ofta för att beräkna dessa intervall över hela nätverket . Escher-FBA stöder inte FVA-beräkningar direkt, men det är möjligt att beräkna dem för en viss reaktion. För att göra detta ska du först föra musen över målfunktionen (biomassareaktionen Biomass_Ecoli_core_w_GAM) och ställa in de övre och nedre gränserna till något mindre än det aktuella flödesvärdet (i standardkartan, försök med 0,870). Därefter kan du föra musen över en intressant reaktion och klicka på knapparna Maximera och Minimera för att se det maximala och minimala flödet genom den reaktionen givet den optimala tillväxthastigheten. Till exempel ger maximering och minimering av flödet genom GAPD i glykolysen ett genomförbart flödesintervall på 15,44-16,68 mmol/gDW/timme, vilket indikerar att det glykolytiska flödet är starkt begränsat vid hög tillväxthastighet. Å andra sidan ger maximering och minimering av flödet genom MALS i glyoxylatshunten ett genomförbart flödesintervall på 0-2,64 mmol/gDW/timme, vilket tyder på att glyoxylatshunten kan vara aktiverad eller inaktiv vid hög tillväxttakt. Denna procedur kan göras med vilken uppsättning reaktioner som helst och användaren kan begränsa sitt system till ett valfritt antal flödesvärden för att se det utbud av lösningar som är tillgängliga för en viss reaktion.
Användning av andra modeller i genomskala
Standardmodellen för E. coli-kärnan är inte det enda systemet som kan simuleras. Om man till exempel vill köra simuleringar på en jästcell kan man ladda ner en modell och karta för Saccharomyces cerevisiae från http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. På den sidan klickar du på nedladdningsknappen för modellen (iMM904.json) och kartan (iMM904.Central carbon metabolism.json). Ladda dessa i Escher-FBA genom att klicka på Load Map JSON i menyn Map och Load Model JSON i menyn Model för att ladda båda JSON-filerna. När kartan har laddats är den redo att redigeras och simuleras med något av verktygen i Escher eller Escher-FBA (fig. 2d). Med en större modell som iMM904 kommer inte alla reaktioner att vara synliga samtidigt, men du kan lägga till en reaktion i visualiseringen. Klicka först antingen på skiftnyckelikonen på sidofältet eller välj Add reaction mode från Edit-menyn. Nu kan reaktioner läggas till genom att klicka var som helst på kartan och välja önskad reaktion från rullgardinsmenyn. Textinmatningsfältet kan användas för att söka efter en reaktion av intresse.
Användning av Escher-FBA på design av mikrobiella cellfabriker
För att ge ett exempel på en forskningshypotes som kan testas med hjälp av Escher-FBA laddade vi modeller i genomskala av E. coli som innehöll två vägar för att producera 1-propanol för kemisk produktion. Dessa vägar analyserades nyligen i en studie om den prediktiva kraften hos modeller i genomskala för simulering av verkliga mikrobiella cellfabriksstammar . Den första modellen innehåller en enda väg för produktion av 1-propanol (Additional file 1) som först rapporterades av Atsumi et al. Den andra modellen omfattar två synergistiska vägar för produktion av 1-propanol (Additional file 2) som först rapporterades av Shen och Liao . Varje modell kan laddas separat (med menyknappen Model > Load COBRA model JSON), och en enda karta över den centrala ämnesomsättningen tillhandahålls som är kompatibel med båda modellerna (Additional file 3, kan laddas med Map > Load Map JSON).
Vi var nyfikna på om det synergistiska tillvägagångssättet för 1-propanoltillverkning – som är känt för att ha ett högre produktionsutbyte – också har en skillnad i den nödvändiga användningen av vägar. Därför laddade vi varje modell individuellt, maximerade utsöndringen av 1-propanol (hoverade över EX_1poh_e och klickade på Maximera), ställde in den nedre gränsen för utsöndringen till 99 % av den maximala, och minimerade sedan flödet genom det första engagerade steget i pentosfosfatvägen, glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PDH2r). De resulterande kartorna visar att de synergistiska vägarna för produktion av 1-propanol är stökiometriskt balanserade med glykolysen, så de kräver inte PPP-aktivitet (fig. 3b). Å andra sidan kräver den enskilda vägen ett betydande PPP-flöde (fig. 3a). Annan väganvändning, såsom det nödvändiga TCA-fluxet för varje fall, kan också utforskas på dessa kartor.
Vägaranvändning för två heterologiska vägar till 1-propanolproduktion i E. coli. Det flöde från pentosfosfatvägen (PPP) som krävs för varje heterolog produktionsväg kan jämföras genom att för det första tvinga produktionen av 1-propanol att vara 99 % av det maximala värdet (genom att fastställa den nedre gränsen för 1-propanolutbytesreaktionen) och för det andra genom att minimera flödet genom det första steget i PPP. (a) Den 1-propanolväg som rapporteras av Atsumi et al. använder en enda väg för att uppnå 1-propanolproduktion. Den kräver ett betydande PPP-flux och har en lägre total avkastning. (b) Den väg som rapporterats av Shen och Liao använder två vägar på ett synergistiskt sätt för att uppnå ett högre utbyte. Vägen är stökiometriskt balanserad med glykolys, så den kräver inget PPP-flöde
Medan Escher-FBA redan kan användas för många FBA-simuleringar direkt i webbläsaren kan ett antal av de exempel som presenteras av Orth et al. för närvarande inte utföras med Escher-FBA . I dagsläget kan Escher-FBA inte utföra funktioner som gen knockout-analyser eller robusthetsanalyser. Escher-FBA använder dock flexibla SVG-representationer för visuella element, så robusthetsanalyser och även grafiska funktioner som fasplan kan läggas till. Vi har upprättat en utvecklingsplan för Escher-FBA (tillgänglig från hemsidan https://sbrg.github.io/escher-fba) och en iterativ utvecklingsprocess för att så småningom möjliggöra komplexa systembiologiska analyser i webbläsaren.