Förbättra lösligheten hos rekombinanta proteiner med hjälp av MBP-tagg

Resurser ”Tekniska resurscenter ”Tekniska resurser för proteiner” ”Tekniska resurser för proteiner” ”Tekniska resurser Notes ”MBP-tagg

E. Coli-expression

Generering av rekombinant protein kräver användning av en expressionsvärd och E. coli är vanligtvis det bästa valet för detta ändamål. Kombinationen av enkel genetik, enkel odling, snabb uttryckning och hög avkastning gör den till en attraktiv värd, medan bristen på ett effektivt posttranslationsmaskineri, kodonanvändningsbias och svårigheten att producera proteiner med högre molekylvikt gör den ofördelaktig. Ett av de största problemen med E.coli-uttryck är dock olösligt uttryck – ett fenomen där rekombinant överexpression resulterar i bildandet av olösliga proteinaggregat som kallas inklusionskroppar.

Sätt att hantera inklusionskroppar och förbättra målproteinets löslighet

När inklusionskroppar bildas brukar forskarna försöka sig på en besvärlig process som kallas in vitro-proteinolubilisering och omvikning för att återfå lösligt protein, eller så försöker de med uttrycksoptimering på process- eller molekylärnivå för att förhindra problem med olöslighet .

Exempel på optimering på processnivå omfattar metoder som inte kräver målkonstruktion. Till exempel optimering av uttrycksförhållanden, justering av tillväxt- och induktionsförhållanden, byte av media, buffertar osv. Ett alternativ skulle vara att pröva en molekylär metod och manipulera målproteinet genom att eliminera oönskade element i dess sekvens genom att skapa trunkeringar eller mutera vissa aminosyror för att göra proteinet mer lösligt. Du kan också använda dig av en rationell, platsstyrd mutagenesemetod som bygger på strukturinformation eller använda dig av en metod för riktad evolution och undersöka lösligheten hos slumpmässiga punktmutanter, deletioner och fragment. Ett bättre och enklare tillvägagångssätt skulle vara att anta en fusionspartnerstrategi och använda en fusionspartner uppströms som skulle göra målproteinet mer lösligt.

Fusionspartnerstrategi för att förbättra proteinets löslighet

Med detta tillvägagångssätt fusioneras ett svåruttryckt protein eller en svåruttryckt peptid till ett annat stabilt, lättlösligt protein för att stabilisera uttrycket, med tanken att fusionsproteinet kommer att driva det resulterande uttrycket. Även om många proteiner är mycket lösliga är de inte alla effektiva som proteinlöslighetsförstärkare. I detta avseende kan maltosbindande protein vara en mycket användbar partner för att öka proteinets löslighet. I en jämförande studie som syftade till att undersöka deras proteinlöslighetsförbättrande egenskaper visade sig E. coli MBP-taggen vara en mycket effektivare proteinlöslighetspartner än glutation-S-transferas (GST) och tioredoxin (TRx).

Figur 1: GenScript scientist rekommendation angående konstruktionsdesign

Om MBP-tagget och dess verkningsmekanism

MBP är ett cirka 42 kDa, naturligt förekommande protein i E. coli, som kodas av genen malE, och som ansvarar för upptag, nedbrytning och transport av maltodextrin, en kolhydrat. Det utvecklades ursprungligen som en proteinexpressionstagg på 1980-talet och är känt för att avsevärt öka lösligheten hos en rad olika nedströmsfusionerade målproteiner. Även om den exakta mekanismen för att öka proteinets löslighet genom MBP-taggen är oklar, är den känd för att stabilisera och skydda sitt nedströms passagerarprotein från proteolytisk nedbrytning under och efter proteinsyntesen. Cytoplasmatiskt utbyte av MBP-fusionerade proteiner är också vanligen högre eftersom fusionsproteinet ger tillförlitliga sammanhang för effektiv översättningsinitiering. Det föreslås också att MBP-tagget kan fungera som en chaperon genom interaktioner genom en lösningsmedelsexponerad hot spot på dess yta som stabiliserar det annars olösliga passagerarproteinet.

Användningen av MBP-tagget

Samtidigt som MBP-tagget har fusionerats till antingen N- eller C-terminus har det visats att det ökar det rekombinanta lösliga uttrycket, men ett vanligt tillvägagångssätt är att fusionera det till N-terminus. Eftersom ingen tagg kan vara idealisk för alla tillämpningar har kombinatoriska taggningsmetoder utvecklats för olika behov för att öka mångsidigheten hos taggar och nedströmstillämpningar. Två affinitetstaggar som uttrycks i tandem tillsammans med en proteasklyvningsplats före målproteinet gör det möjligt att använda flera reningsstrategier. Genom att införliva en löslighetsförbättrande tagg i kombination med en reningstagg uppnås förbättringar av proteinets löslighet och uttrycksresultat samt metoder för effektiv rening

Figur 2: En allmän schematisk bild för konstruktionsdesignstrategi – en kombination av affinitets-/löslighetstagg vid N-terminus, proteolytisk klyvningsställe följt av målproteinet kan ge goda resultat, särskilt för olösliga målproteiner. En länksekvens kan ofta hjälpa till med problem med proteolytisk klyvning.

Purifiering av MBP-märkta proteiner

En annan fördel med att använda en MBP-fusionsstrategi, förutom att öka proteinets löslighet, är att underlätta reningen av målproteinet nedströms. MBP är en naturlig affinitetsmärkning som binder till amylosekåda och den kan användas för affinitetsrening i ett enda steg genom att binda till tvärbunden amylos. MBP-tagg-fusionerade rekombinanta proteiner som är bundna till immobiliserad amylos elueras vanligtvis under icke denaturerande förhållanden med hjälp av maltos .

Nackdelar med denna strategi

• Målproteinklyvning kan vara ett problem på grund av steriskt hinder från MBP-tagget
• Amyloseharts kan vara ömtåligt och relativt dyrt
• Målproteinutfällning efter klyvning
• Vissa MBP-fusionsproteiner binder inte effektivt till amylosharts, och även när de gör det,

Slutsats

Det finns ingen enkel, global lösning för att lösa problemen med olöslighet i E.coli-expression, kan en välutvecklad konstruktion och en noggrant utarbetad expressionsstrategi ge dig det önskade lösliga proteinet. MBP är en tillförlitlig löslighetsmärkning för produktion av rekombinanta lösliga proteiner och även om löslighet är en av de viktigaste delarna av en proteinproduktionskampanj bör slutmålet inte alltid handla om löslighet. Expressionsnivåer, proteinaktivitet, renhet, homogenitet och stabilitet är alla viktiga faktorer som också måste beaktas innan man ger sig in i en kampanj för produktion av rekombinanta proteiner.

Få publikationer som visar på nyttan av MBP-taggen

Produktion av Fusokiner med hjälp av MBP -Maltose-.Binding Protein Fusion möjliggör bakterieexpression på hög nivå och rening av bioaktiva däggdjurscytokinderivat (september 2014)

Räddning av aggregerings-benägna proteiner med hjälp av MBP -Räddning av aggregationsbenägna proteiner i Escherichia coli med en dubbel His₆-MBP-tagg (maj 2014)

MBP för produktion av lösliga proteiner i E. coli -Hexahistidinmärkt maltosbindande protein som fusionspartner för produktion av lösliga rekombinanta proteiner i Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., och Leiting, B. (1997). Uttryck på hög nivå av lösligt protein i Escherichia coli med hjälp av ett system för dubbelaffinitetsfusion av His6-tag och maltosbindande protein. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. och Waugh, D. S. (2002). Differentiella effekter av kompletterande affinitetsmärken på lösligheten hos MBP-fusionsproteiner. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J. och Waugh, D. S. (2005) Gateway-vektorer för produktion av kombinatoriskt taggade His6-MBP-fusionsproteiner i cytoplasma och periplasma hos Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Enstaka aminosyrasubstitutioner på ytan av Escherichia coli maltosbindande protein kan ha en djupgående inverkan på lösligheten hos fusionsproteiner. Protein Sci 2001, 10:622-630

Planerar du ett projekt för bakterieexpression? Få en kostnadsfri offert inom några sekunder för våra BacPower™ Guaranteed protein expression packages.

Offerter och beställning

#Den automatiska offerten kommer att genereras endast om sekvenser kvalificerar sig för den garanterade tjänsten, enligt vad som bestäms av vår egenutvecklade sekvensanalysplattform, och i annat fall kommer vår tekniska kundansvarige att kontakta dig med en offert för anpassad proteinproduktion. Du kan vara säker på att våra skräddarsydda tjänster är lika högkvalitativa och konkurrenskraftiga som våra garanterade tjänster.

Våra kundtjänstrepresentanter är tillgängliga dygnet runt, måndag till fredag, för att hjälpa dig.