Frontiers in Medicine

Introduktion

Koloskopi är den metod som föredras för att utvärdera tarmhälsan hos de flesta patienter, och det är den gyllene standarden för att diagnostisera kolorektalcancer, som tydligt kan upptäcka tarmförändringar (1). Före koloskopi används vanligen tarmberedning för att säkerställa att inga rester kvarstår i tarmväggen för att påverka undersökningsprocessen och resultaten genom att använda anpassad kost och relaterade läkemedel, och tarmberedningens tillräcklighet kan direkt påverka den slutliga effekten av koloskopin (2). För närvarande används polyetylenglykol (PEG) i stor utsträckning för tarmrengöring före koloskopi på grund av dess effektivitet och omfattande acceptans (3).

Som vi vet är den intestinala mikrobiotan viktig för att upprätthålla människors hälsa. Under fysiologiska förhållanden samexisterar symbiotiska fysiologiska anaeroba bakterier, symbiotiska villkorliga patogena bakterier och andra skadliga bakterier i tarmkanalen i en stabil proportion. När tarmmikrobiotan förändras eller när proportionen av tarmmikrobiotan är obalanserad uppstår dock motsvarande patofysiologiska förändringar (4). Under tarmförberedelseförfarandet kommer stora mängder vätska in i tarmkanalen och stör avsevärt miljön i den normala tarmhålan, och intag av laxermedel kan öka tarmens dyskinesi och tarmperistaltik, vilket gör att bakterier inte kan fästa vid tarmslemhinnan (5). Dessutom minskar den stora mängden syre som tarmberedningen för med sig i tarmmiljön kraftigt antalet anaeroba bakterier och främjar tillväxten av aeroba bakterier, vilket resulterar i mikrobiella störningar i tarmen (6).

Probiotika är ”levande mikroorganismer som kan ha gynnsamma effekter på värden när de intas i tillräckliga doser” (7), tidigare studier tyder på att probiotika spelar en aktiv roll i en mängd olika mänskliga sjukdomar, inklusive irritabelt tarmsyndrom, inflammatorisk tarmsjukdom och koloncancer (8, 9). Våra tidigare studier tyder på att probiotiska preparat har viktiga effekter när det gäller att minska inflammatoriska reaktioner efter gastrostomi och förbättra gastrointestinala symtom hos postoperativa patienter (10), och probiotiska preparat lindrade också avsevärt inflammation i munslemhinnan som orsakades av strålbehandling hos patienter med nasofaryngealt karcinom (11). Även om man har uppmärksammat biverkningarna av tarmpreparat, t.ex, obalans i tarmmikrobiotan och skador på tarmslemhinnan i akademiska kretsar, har det gjorts lite arbete för att minska biverkningarna av tarmpreparat med hjälp av probiotiska tillskott.

I den här studien användes det kliniska probiotiska läkemedlet Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets för att utvärdera effekten på frivilliga som fick tarmpreparat, och sekvensering med högt genomströmningsvärde tillämpades för att utvärdera om probiotika hade positiva effekter på tarmmikrobiotans störning som orsakades av tarmpreparat.

Material och metoder

Etiskt uttalande

Denna studie godkändes av Institutional Review Boards of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University (Nanchang, Kina). Patienterna gav skriftligt informerat samtycke till provtagning. Projektet har också registrerats och godkänts av China Clinical Trial Registration Centre (ChiCTR1900022539).

Studieutformning och patientrekrytering

Studien genomfördes på Second Affiliated Hospital of Nanchang University i Kina mellan december 2018 och november 2019. Trettiotvå försökspersoner (29 män, 3 kvinnor), med en genomsnittlig ålder på 51 år (intervall 30-70 år), längd på 1,66 m, vikt på 61,78 kg, kroppsmasseindex (BMI) på 22,39, rekryterades. Fem deltagare hade en historia av högt blodtryck, fyra hade en historia av diabetes och tre hade en historia av högt blodtryck och diabetes. I enlighet med bestämmelserna avbröts inte medicineringen under studiens gång. Dessutom tog ingen deltagare antibiotika under ämnet och hade inte heller utvecklat en infektion nyligen, och inga andra probiotika och yoghurtar intogs. Ingen av dessa frivilliga var vegetarian (tabell 1).

Protokoll för försöket

De 32 frivilliga delades in i två grupper: placebogrupp (C-gruppen, n = 16) och probiotikagrupp (P-gruppen, n = 16). Probiotiska (Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets (SiLianKang), Hangzhou Grand Biologic Pharmaceutical Inc., Hangzhou, Kina. SFDA:s godkännandenummer: S20060010, innehållande >0,5 × 106 CFU/tabell Bifidobacterium infantis, >0,5 × 106 CFU/tabell Lactobacillus acidophilus, >0,5 × 106 CFU/tabell Enterococcus faecalis och >0,5 × 105 CFU/tabell Bacillus cereus). Deltagarna föreslogs äta gröt, nudlar och annan fiberfattig kost dagen före tarmförberedelsen och åt normal kost efter koloskopin. Antibiotika förbjöds under behandlingsprocessen, liksom drickande och akrimoni. Alla började ta placebo eller probiotiska preparat efter koloskopin i upp till 5-7 dagar (tre tabletter och tre gånger om dagen).

Deltagarna tog 2 L polyetylenglykol (PEG, SFDA:s godkännandenummer: H20020031, innehållande förpackning A: 0,74 g kaliumklorid och 1,68 g natriumbikarbonat, förpackning B: 1,46 g natriumklorid och 5.68 g natriumsulfat, förpackning C: 60 g polyetylenglykol 4 000) 4-5 h före koloskopi och PEG ska tas fullständigt inom 1 h. Efter intravenös anestesi med 1 ml lidokainhydrokloridinjektion (SFDA-godkännandenummer: H37021309), 1 ml nalbufinhydrokloridinjektion (SFDA-godkännandenummer: H20130127) och 20 ml injektion av propofolemulsion (SFDA-godkännandenummer: H20051843) genomgick deltagarna koloskopi. Om deltagarna var intoleranta under koloskopin lades bedövningsmedel till vid behov. Fekalier i 3 tidspressningar (3 dagar före, samma dag som tarmförberedelsen strax före koloskopin och 7 dagar efter processen) samlades in. De insamlade proverna förvarades i 50 % glycerol (Cat#56-81-5; Sengon Biotech, Kina) och förvarades omedelbart vid -80 °C för vidare användning.

Total bakteriellt genomiskt DNA-extraktion och sekvensering med högt genomflöde

Totalt 96 avföringsprover samlades in, och metoden bead blasting kombinerad med genomiskt DNA-kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kina) användes för att extrahera fekalt mikrobiellt DNA (12). Koncentrationen och renheten hos det renade DNA:t bestämdes med hjälp av en spektrofotometer vid 230 nm (A 230) och 260 nm (A 260) (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). V4-regionen i 16S rDNA-genen i varje prov amplifierades med primer 515F/806R (515F, 5′-GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3′; 806R, 5′- TACNVGGGGTATCTAATCC-3′), och PCR-produkterna sekvenserades på IlluminaHiSeq 2000-plattformen (GenBank-anslutningsnummer PRJNA597277) (13).

Dataanalys

För att analysera sekvenseringsdata med högt genomflöde användes Cutadapt (version 1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/), UCHIME-algoritmen http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html, mjukvarupaketet UPARSE (version 7.0.100), QIIME-programvara (version 1.9.1), QIIME-programvarupaket (version 1.8.0) och SIMCA-P-programvara (version 11.5; Umetrics; Sartorius Stedim Biotech, Malmö, Sverige) användes för att bestämma α-diversitet (inom prover, index för observerade OTU:er, Chao1, Shannon, Simpson, ACE och godstäckning) och β-diversitet (mellan prover, PCA, PCoA och NMDS) (14, 15).

Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Statistiska analyser utfördes med hjälp av programvaran Prism (version 7.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) och programvaran SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av envägsvariansanalys (ANOVA) följt av Tukey’s multipeljämförelsetest och F-test. Felsannolikheter på P < 0,05 betraktades som statistiskt signifikanta.

Resultat

Patienternas baslinjemässiga egenskaper

Mellan december 2018 och november 2019 rekryterades 32 frivilliga till placebogruppen (C-gruppen, 16 frivilliga) och probiotikagruppen (P-gruppen, 16 frivilliga), och deras kön, ålder, BMI, baslinjemässiga egenskaper, tidigare sjukdomshistoria och gastrointestinala reaktioner före och efter tarmpreparatet sammanfattades i tabell 1. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan C-gruppen och P-gruppen.

Effekt av tarmberedning på tarmmikrober

För att undersöka om tarmberedning kan påverka tarmmikroorganismerna amplifierades den hypervariabla V4-regionen hos bakterier med hjälp av 16S rDNA-amplikonsekvenseringsmetoden från avföring från 16 frivilliga före (CB-gruppen), under (CM-gruppen) och efter tarmberedning (CA-gruppen).

I figurerna 1A-C visade Shannon-index, Simpson-index och observerade arter att förekomsten av tarmberedning påverkade α-diversiteten i tarmens mikrobiella samhälle något mellan CB- och CM-grupperna, CB- och CA-grupperna, medan den mikrobiella diversiteten mellan CM- och CA-grupperna påverkades signifikant (P < 0,05). Och huvudkoordinatsanalysen (PCoA) visade att den mikrobiella mångfalden i CM-gruppen och CA-gruppen skilde sig från den i CB-gruppen (figur 1D). Dessutom visade resultaten från Venn-indexet (figur 1E) att det fanns 2 068, 3 426 och 1 695 OTU:er i CB-, CM- och CA-grupperna, och deras procentuella andel av gemensamma OTU:er var 27,71 % (573/2 068), 16,73 % (573/3 426) respektive 33,81 % (573/1 695).

Fortfarande analyserade vi vidare de dominerande bakterierna på fylumnivå (figurerna 2A-E) och fann att Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes och Actinobacteria var de dominerande fylerna i dessa 3 grupper. Resultaten visade att tarmberedning ökade den relativa förekomsten av Proteobacteria (0,266 vs. 0,410) medan den minskade den relativa förekomsten av Actinobacteria (0,044 vs. 0,029), och hade en liten effekt på den relativa förekomsten av Firmicutes (0,462 vs. 0,408) och Bacteroidetes (0,194 vs. 0,136) jämfört med CB-gruppen. Sju dagar efter tarmberedningen minskade den relativa abundansen av proteobakterier från 0,410 till 0,335. Märkligt nog ökade den relativa abundansen av Actinobacteria från 0,029 till 0,119, medan den relativa abundansen av Firmicutes (0,409 vs. 0,389) och Bacteroidetes (0,136 vs. 0,126) fortfarande visade en minskande trend jämfört med CM-gruppen. På genusnivå (figurerna 2F-J) observerades under tarmberedningen att den relativa abundansen av Bacteroides och Acinetobacter var dominerande bakterier, den relativa abundansen av Acinetobacter (0,042 vs. 0,176) var signifikant ökad, och den relativa abundansen av Streptococcus (0,020 vs. 0,008), Bifidobacterium (0,036 vs. 0,022) och Faecalibacterium (0,075 vs. 0,065) var något förändrad jämfört med CB-gruppen. Sju dagar efter tarmpreparationen fanns det dock en signifikant ökning av andelen Streptococcus (0,007 vs. 0,068) och Bifidobacterium (0,022 vs. 0,068) och Bifidobacterium (0,022 vs. 0,068).109) och en minskning av den relativa förekomsten av Faecalibacterium (0,065 vs 0,031) och Acinetobacter (0,176 vs 0,136) jämfört med CM-gruppen.

Effekt av probiotikapreparat på den intestinala mikrobiella balansen

För att utvärdera probiotikas effekter på den intestinala mikrobiella balansen hos frivilliga som fick tarmpreparat samlades avföring in före (PB-grupp), under (PM-grupp) och efter tarmpreparat (PA-grupp) i 7 dagar (har tagit probiotikapreparat i 5-7 dagar).

Vi observerade att tarmpreparatet hade påverkat α-diversiteten på Shannon-indexet (figur 3A) och Simpson-indexet (figur 3B, P < 0,05) i det mikrobiella samhället markant mellan PB- och PM-gruppen. Intressant nog fick de observerade arterna en tydlig ökning efter tarmberedningen men en tydlig minskning 7 dagar efter behandlingen (figur 3C). Dessutom visade PCoA-resultaten att probiotikaintag i hög grad återställde den störda mikrobiotan till normal nivå i PM-gruppen och PA-gruppen (figur 3D), och de vanliga OTU:erna upptog 28,68 % (508/1 771), 23,67 % (508/2 146) och 36,92 % (508/1 376) av de totala OTU:erna i PB-, PM- respektive PA-grupperna.

Därefter utvärderade vi ytterligare effekterna av probiotisk intervention på den mikrobiella sammansättningen och fann att tillskott av probiotika signifikant reducerade Proteobacteria (0.515 vs. 0,173) och ökade kraftigt den relativa abundansen av Bacteroides (0,166 vs. 0,338) i PM-gruppen jämfört med PA-gruppen på fylumnivå (P < 0,05). På genusnivå hade de tillförda probiotikorna uppenbarligen minskat den procentuella andelen Acinetobacter (0,204 vs. 0,071) i PM-gruppen jämfört med PA-gruppen, och signifikant ökat den procentuella andelen Bifidobacterium (0.017 vs. 0,110), Bacteroides (0,095 vs. 0,155) och Faecalibacterium (0,028 vs. 0,060) i PM-gruppen jämfört med PA-gruppen (figur 4F-J).

De mikrobiella förändringarna mellan grupperna CA-grupp och PA-grupp

För att bättre förstå probiotikas effekt på tarmförberedelsen jämförde vi den mikrobiella mångfalden mellan volontärer i grupperna CA och PA. Som framgår av figurerna 5A-C hade tillskott av probiotika markant förbättrat Shannon-indexet och Simpson-indexet (P < 0,05), samtidigt som de observerade arterna minskade. PCoA-resultaten visade att proverna i CA-gruppen och PA-gruppen spreds långt ifrån varandra (figur 5D). Det fanns 1 695 och 1 376 OTU:er i CA-gruppen och PA-gruppen, och det gemensamma OTU-antalet var 570 (figur 5E). Dessutom visade Lefse-analysen att Bacteroidia (i klassen), Bacteroidetes (i fylum), Bacteroidaceae (i familjen), Bacteroides (i släktet), Fusobacteriaceae (i släktet), Porphyromonadaceae (i släktet) och Parabacteroides (i släktet) var signifikant högre i PA-gruppen än i CA-gruppen (figur 5F).

Därefter jämfördes specifika bakterier i CA-gruppen och PA-gruppen. Tillskott av probiotika berikade markant andelen Bacteroidetes (0,126 vs. 0,338), samtidigt som andelen Proteobacteria (0,335 vs. 0,173) och Firmicutes (0,389 vs. 0,330) minskade jämfört med PA-gruppen på fylumnivå (P < 0,05). På genusnivå (figurerna 6E-K) minskade tillskottet av probiotika den relativa abundansen av Acinetobacter (0,136 vs. 0,071) och Streptococcus (0,068 vs. 0,023), medan den relativa abundansen av Bacteroides (0.068 vs. 0,155), Roseburia (0,02 vs. 0,04), Faecalibacterium (0,031 vs. 0,060) och Parabacteroides (0,16 vs. 1,92 %).

Diskussion

Tarmrengöring är nödvändig under koloskopi, och dess långvariga användning av säkerhet gör att människor ignorerar dess negativa inverkan på tarmmikroorganismer (16). Som vi vet utgör kolonimikroorganismerna grunden för att främja normala fysiologiska funktioner hos däggdjur, inklusive angiogenes, metabolism, matsmältning och utveckling av immunsystemet (17). Dessutom uppstår olika sjukdomar, inklusive fetma, typ 2-diabetes, kolorektalcancer och inflammatorisk tarmsjukdom, när tarmmikrobiotan är i obalans (8, 9, 18).

De viktigaste komponenterna i det normala tarmmikroekosystemet är obligata anaerober (Bacteroidetes och Firmicutes), och fakultativa anaerober (t.ex. proteobakterier) utgör vanligtvis bara en liten andel, och obalansen i tarmmikrobiota orsakas ofta av ett ökande antal fakultativa anaerober (19). Tarmberedningen kan föra in en stor mängd syre i tarmhålan, skada den anaeroba miljön i tarmhålan och ge en bra tillväxtmiljö för fakultativt anaeroba eller aeroba bakterier. Tidigare studier och föreliggande arbete visade likaså att tarmpreparatet hade kraftigt ökat förekomsten av Proteobacteria .

I den här studien fann vi att tarmpreparatet signifikant minskade fylla Bacteroidetes och Firmicutes (figur 2), och att intag av probiotika hade liten effekt på fylla Firmicutes, medan förekomsten av Bacteroidetes ökade kraftigt (figur 4). Tidigare studier hade visat att ökningen av mängden Firmicutes och minskningen av mängden Bacteroidetes var nära relaterade till ohälsosamma förhållanden. Därför kan ökningen av Firmicutes/Bacteroidetes utgöra en potentiell risk för patientens hälsa (20-22). I den aktuella studien fann vi att förhållandet Firmicutes/Bacteroidetes i CA-gruppen (3,08) var högre än i PA-gruppen (0,98), vilket tyder på att intag av probiotika skulle kunna minska de potentiella sjukdomsriskerna genom tarmberedning. Dessutom har människokroppen vanligtvis inte förmågan att bryta ned de flesta komplexa polysackarider (huvudkomponenten och huvudnäringskällan i vår dagliga kost) förrän de når tjocktarmen, och Bacteroidetes spelar en viktig roll i nedbrytningen av komplexa polysackarider av cellulosa, pektin och xylan, vilket kan hjälpa människor att absorbera mer energi från kosten (23). Dessutom spelar butyrat som produceras av Bacteroidetes en viktig roll för att upprätthålla värdens tarmhälsa, utöva immunitet och anti-tumoreffekt (24).

På genusnivå minskade tillskott av probiotika signifikant överflödet av Acinetobacter som är en vanlig aerob och gramnegativ bakterie i naturen, som tillhör en viktig patogen som orsakar sjukhusinfektion särskilt hos patienter med låg immunförsvar (Acinetobacter baumannii) (25). Acinetobacter hade listats som den tredje vanligaste humana patogenen på intensivvårdsavdelningen på sydkoreanska sjukhus, och dess inneboende läkemedelsresistens mot en rad olika antibiotika gjorde att den erhöll bestämningsfaktorer för läkemedelsresistens mot olika antibakteriella läkemedel (26). Dessutom minskade tarmberedning avsevärt nivån av Bacteroides, och probiotika återställde uppenbarligen dess förekomst. Studier hade visat att Bacteroides kan minska tarmens syrehalt för att främja tillväxten av strikta anaerobier (23) och vissa stammar av Bifidobacterium har tagits i bruk som probiotika i livsmedel och medicin (10, 27). Bacteroides och Bifidobacterium kan etablera en stabil och långsiktig kontakt med värden och gynna hälsan i människokroppen, kan bryta ner kostfibrer till kortkedjiga fettsyror (SCFA), vilket ger energikälla för cellerna, främjar barriärfunktionen och minskar förekomsten av inflammatoriska reaktioner (28, 29).

I slutändan jämförde vi den mikrobiella mångfalden av CA och PA, och fann att om man tog probiotika ökade övervägande överflödet av fördelaktiga bakterier som Roseburia (huvudsakligen eller endast producerar butyrat, vilket kan minska inflammationsnivån i hela, särskilt i blodet, ytterligare minska graden av ateroskleros. Det förblir lägre nivåer hos personer med kardiovaskulära sjukdomar) (30, 31), Faecalibacterium (en symbiotisk bakterie som förekommer allmänt i mag-tarmkanalen hos djur och människor. Den var signifikant reducerad hos Crohns patienter och kan användas som probiotika för att behandla Crohns sjukdom) (32-34) och Parabacteroides (kan motstå tarminflammation, de viktigaste metaboliska slutprodukterna är fördelaktig ättiksyra och bärnstenssyra, som är lägre än det normala intervallet i tarmkanalen hos patienter med kolit) (35-37) på genusnivå. Trots detta minskade förekomsten av skadliga bakterier som Streptococcus markant (figurerna 5 och 6). Streptokocker är en vanlig opportunistisk patogen, inklusive Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans och Streptococcus pneumoniae, som kan orsaka purulent inflammation, endokardit och septikemi, vilket ytterligare hotar människors hälsa och liv (38, 39). Haenni et al. angav att på grund av den utbredda användningen av tetracyklin-, makrolid- och linkosamidantibiotika inom den globala djursektorn har antibiotikaresistens hos Streptococcus zooepidermidis uppstått, vilket leder till att behandlingen misslyckas (40, 41).

I den aktuella studien fann vi att orala probiotika lindrade den intestinala mikrobiella störningen orsakad av tarmberedning, minskade kraftigt patogenerna av Proteobacteria (på fylumnivå), Acinetobacter (på genusnivå), Streptococcus (på genusnivå), och ökade probiotikerna av Bacteroidetes (på fylumnivå), Bacteroides (på genusnivå), Roseburia (på genusnivå), Faecalibacterium (på genusnivå) och Parabacteroides (på genusnivå). Därför har vi skäl att tro att tillskott av probiotiska preparat kommer att påskynda etableringen av tarmens mikrobiella balans efter rengöring av tarmen, undertrycka tillväxten av skadliga bakterier och gynna upprätthållandet av tarmhälsa.

Data Availability Statement

De dataset som genererades för denna studie finns i NCBI: GenBank accession number PRJNA597277.

Etik uttalande

Studierna med mänskliga deltagare granskades och godkändes av Institutional Review Boards vid Second Affiliated Hospital of Nanchang University (Nanchang, Kina). Projektet har också registrerats och godkänts av China Clinical Trial Registration Center (ChiCTR1900022539). Patienterna/deltagarna gav sitt skriftliga informerade samtycke till att delta i denna studie.

Författarnas bidrag

TC och XD utformade experimenten, analyserade data och skrev manuskriptet. CZ, HT, RY, ZL, YH och KW utförde experimenten. Alla författare diskuterade resultaten och kommenterade det slutliga manuskriptet.

Finansiering

Detta arbete stöddes av bidrag från Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (Grant No. 81960103 till XD), Jiangxi-provinsens naturvetenskapliga stiftelse (Grant No. 20192ACBL20034 till ZL), Jiangxis vetenskapliga och teknologiska projekt (Grant Nos. 20181BBG70028, 20181BCB24003 och 20194BCJ22032 till TC), och Jiangxi-provinsens dubbla tiotusenplan till TC (yrkesverksamma inom innovation och teknik som de bästa talangerna).

Intressekonflikter

Författarna förklarar att forskningen har utförts i avsaknad av kommersiella eller ekonomiska relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

.