Identifiering, karakterisering och verifiering av proteinerna 130 och 131 som 14-3-3
Figur 1.
Figur 1. Områden av silverfärgade geler som visar proteinfläckar 130 och 131 efter tvådimensionell elektrofores.
Panel A visar normal cerebrospinalvätska där fläckarna 130 och 131 saknas. Panel B visar cerebrospinalvätska från en patient med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom; pilarna pekar på fläckarna 130 och 131. Gelerna i panelerna C och D är från ett extrakt av normal mänsklig hjärna. Panelerna A, B och C visar samma gelregion, med isoelektriska punkter från 4,8 till 6,0 (från vänster till höger) på x-axeln och storlekar från 10 till 40 kd (från botten till toppen) på y-axeln. Den streckade rutan i panel C visar den region som visas i panel D från en gel med ett pH-område på 4,5 till 5,4. Pilarna i panelerna B och C visar platsen för fläckarna 130 och 131, som är märkta i panel D.
Resultaten av tvådimensionell elektrofores för detektion av cerebrospinalvätskeproteiner 130 och 131 hos patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom visas i figur 1A och figur 1B. Nya tekniska förbättringar har resulterat i ökad upplösning, med sex fläckar i stället för de två (motsvarande proteinerna 130 och 131) som ursprungligen beskrevs. För att hitta en riklig källa till dessa proteiner undersökte vi normal hjärnvävnad för att avgöra om några hjärnproteiner finns i närheten av konstellationen av fläckar som motsvarar cerebrospinalvätskans proteiner 130 och 131. Figur 1C visar en region av en silverfärgad gel efter tvådimensionell elektrofores av normala hjärnproteiner. Flera av proteinerna förekommer i samma område som 130-131-konstellationen, inklusive två som har samma laddning och massa som 130-131-konstellationen i cerebrospinalvätska. Identifieringen av de två fläckarna på grundval av deras position bekräftades genom komikstudier. Punkt 130 renades genom tvådimensionell elektrofores med smal räckvidd (pH-område, 4,5 till 5,4), vilket visas i figur 1D.
Punkt 130 utklipptes från 10 blottar, enzymatiskt digererades och mikrosekvenserades. Aminosyrasekvenser erhölls från fyra peptidfragment. Tre av dessa sekvenser, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys och Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, stämde med sekvensen för det mänskliga 14-3-3-proteinet, isoform eta. Den fjärde sekvensen, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, stämde överens med nötkreaturets 14-3-3-protein, isoform gamma.
14-3-3-antikroppen reagerade specifikt med cerebrospinalvätskeproteinerna 130 och 131 på ett tvådimensionellt elektroforetiskt immunoblot men reagerade inte med andra cerebrospinalvätskeproteiner, vilket bekräftar att cerebrospinalvätskeproteinerna 130 och 131 är 14-3-3-proteiner.
14-3-3-immunoassay
Figur 2.
Figur 2. Immunfärgning för anti-14-3-3β polyklonala kaninantikroppar efter natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores.
Fåra 1 visar cerebrospinalvätska från en patient med patologiska tecken på Alzheimers sjukdom, körfält 2 och 3 visar cerebrospinalvätska från två patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, körfält 4 visar cerebrospinalvätska från en normal ko, körfält 5 visar cerebrospinalvätska från en ko med experimentellt framkallad transmissibel minkencefalopati och patologiska tecken på spongiform sjukdom, spår 6 visar normalt humant serum, spår 7 visar serum från en patient med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, spår 8 visar ett extrakt av normal mänsklig hjärna och spår 9 visar renat prionprotein från hjärnan hos en patient med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom.
Upptäckten att de 30-kd fläckarna i cerebrospinalvätskan (proteinerna 130 och 131) är 14-3-3-proteiner ledde till utvecklingen av en enkel immunoassay som hjälp vid diagnosen av transmissibel spongiform encefalopati. Som framgår av figur 2 fanns det i cerebrospinalvätska från patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom ett immunoreaktivt 30-kd-band (körfält 2 och 3), medan inget sådant band upptäcktes i cerebrospinalvätska från friska kontroller (data visas inte) eller från en patient med Alzheimers sjukdom (körfält 1). Som förväntat var 14-3-3 rikligt förekommande i ett extrakt av normal mänsklig hjärna (körfält 8). 14-3-3-proteinet hittades inte i normalt serum (körfält 6), men det upptäcktes inte heller i serum från patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (körfält 7). Prionprotein som renats från hjärnan hos en patient med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (körfält 9) korsreagerade inte med 14-3-3-antikroppen, vilket bekräftar att 14-3-3-3 inte är ett prionprotein.
Tabell 1.
Tabell 1. Cerebrospinalvätskeprover som utvärderats med 14-3-3-immunoassay, beroende på diagnos. Tabell 2.
Tabell 2. Känslighet och specificitet för 14-3-3-immunoassay för Creutzfeldt-Jakobs sjukdom.
Sjuttioåtta av 71 cerebrospinalvätskeprover från patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (96 procent) var positiva för 14-3-3 (tabell 1 och tabell 2). Fyra av 94 prover (4 procent) från patienter med andra demenssjukdomar var positiva för 14-3-3 (tabell 1 och tabell 2) (P<0,001). När patienter med demenssjukdom som man visste hade haft akuta infarkter i hjärnan inom en månad före testningen uteslöts från analysen var dessutom endast 1 av 91 prover (1 procent) positivt (P<0,001). Prover från alla 10 patienter med multiinfarktdemens men utan stroke under månaden före testningen var negativa för 14-3-3. Det enda falskt positiva resultatet bland cerebrospinalvätskeproverna från de övriga patienterna med demens var från en patient med en klinisk diagnos av Alzheimers sjukdom som inte hade verifierats genom patologiska studier.
14-3-3 påvisades i 18 av 66 cerebrospinalvätskeprover (27 procent) från patienter med andra neurologiska sjukdomar som inte innebar demens. De 18 positiva proverna kom från patienter med akut viral encefalit, stroke (utan demens) inom en månad före testet, subarachnoidalblödning eller Retts syndrom. Creutzfeldt-Jakobs sjukdom kunde inte rimligen inkluderas i differentialdiagnosen för någon av dessa sjukdomar.
Totalt var känsligheten för 14-3-3-immunoassayet som markör för Creutzfeldt-Jakobs sjukdom 96 procent (68 sant positiva resultat dividerat med 71 sant positiva och falskt negativa resultat; 95-procentigt konfidensintervall, 92 till 99 procent), och specificiteten 88 procent (164 sant negativa resultat dividerat med 186 sant negativa och falskt positiva resultat; 95-procentigt konfidensintervall, 84 till 92 procent). Ännu viktigare är att specificiteten för detta test bland alla patienter med demens var 96 procent (90 sant negativa resultat dividerat med 94 sant negativa och falskt positiva resultat; 95-procentigt konfidensintervall, 90 till 96 procent), och när de tre patienterna med demens och hjärninfarkt inom en månad före testningen uteslöts, var immunoassayets specificitet 99 procent (90 sant negativa resultat dividerat med 91 sant negativa och falskt positiva resultat; 95-procentigt konfidensintervall, 97 till 100 procent) (tabell 1 och tabell 2).
För jämförelse av tvådimensionell elektrofores och immunoassay
Tabell 3.
Tabell 3. Jämförelse av tvådimensionell elektrofores för proteinerna 130 och 131 och 14-3-3-immunoassay.
Vi jämförde den tvådimensionella elektroforesanalysen för proteinerna 130 och 131 med 14-3-3-immunanalysen i 50 cerebrospinalvätskeprover (tabell 3). Tretton av 15 prover från patienter med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom var positiva med båda testerna, och de andra två proverna var negativa för proteinerna 130 och 131 men positiva för 14-3-3-proteinet. Resultaten av de två testerna var desamma i prover från patienter med demenssjukdomar som inte är associerade med Creutzfeldt-Jakobs sjukdom eller andra neurologiska sjukdomar. Även om specificiteten hos de två testerna är likartad har 14-3-3-immunoassayet en något högre känslighet.
14-3-3-immunoassay på djur
Tabell 4.
Tabell 4. Resultat av 14-3-3-immunoassay i cerebrospinalvätskeprover från djur.
Resultaten av studierna på djur överensstämde med resultaten av studierna på människor. Figur 2 visar analysresultaten i cerebrospinalvätska från en normal ko (körfält 4) och en ko med patologiska tecken på transmissibel spongiform encefalopati (körfält 5). Som framgår av tabell 4 påvisades 14-3-3-protein i cerebrospinalvätska från sex av nio nötkreatur med experimentellt framkallad transmissibel minkencefalopati eller scrapie. Den enda ko som hade kliniska symptom men inga patologiska bevis på transmissibel spongiform encefalopati hade också ett positivt test. Inga kontrollboskap hade positiva tester. Testet var positivt hos fem av sex får med naturligt förvärvad skrapie och negativt hos det ena kontrollfåret. Alla 15 experimentellt infekterade schimpanser hade positiva tester, medan ingen av de 77 kontrollschimpanserna hade det. Den totala känsligheten för 14-3-3-immunoassayet hos djur var 87 procent och den totala specificiteten var 99 procent.