Kinetiskt begränsad differentiell centrifugering som ett billigt och lättillgängligt alternativ till centrifugal elutriation

I många tillämpningar vill man separera målceller från blandningar som innehåller andra celler med liknande densitet, men med olika storlek (antingen lite eller mycket). Som exempel kan nämnas generering av synkroniserade cellkulturer där man isolerar celler i ett visst skede av sin cykel (som kännetecknas av sin storlek) (1-2), isolering av kortikotropa celler från andra hypofysceller (3) och sortering av olika subpopulationer av monocyter (4). Den metod som väljs för att separera cellpopulationer baserat på skillnader i sedimentationshastighet (särskilt när densitetsskillnaderna inte är betydande) är en process som kallas centrifugal elutriation (5). Här utsätts separanderna (vanligtvis celler) för två krafter: (I) en centrifugalkraft som får dem att sedimentera med en hastighet som är en funktion av deras densitet och storlek, och ii) ett konvektivt flöde i motsatt riktning som ger alla celler en fast hastighet. Flödet och/eller centrifugeringshastigheten kan justeras för att samla in endast de celler vars sedimentationshastighet ligger inom ett visst intervall. Denna process har också använts med framgång för att separera bakterieceller från matriser där de finns (6) (vår tillämpning av intresse), men behovet av specialutrustning utgör ett hinder för många laboratorier.

Och även om det finns ett antal protokoll som har beskrivits för att isolera bakterier från olika matriser, t.ex. livsmedel (7-8), jord (9) och mikrobiella mattor (10), där man använder sig av lätt tillgängliga bänkcentrifuger för att separera celler på grundval av olika sedimenteringshastigheter, förefaller de rekommenderade protokollen ofta att vara ad hoc. Wang et al. (8) rekommenderade till exempel centrifugering vid <1000×g under en ospecificerad tid för att avlägsna skräp vid isolering av bakterier från mjukost, följt av centrifugering vid 9000×g i 3 minuter för att samla in bakterier. För isolering av bakterier från homogeniserat kött rekommenderar Neiderhauser et al. (7) centrifugering vid 100×g (under en ospecificerad tid) för att avlägsna matpartiklar, följt av centrifugering vid 3000×g (återigen under en ospecificerad tid) för att samla in bakterier. I andra fall omfattar de rekommenderade protokollen flera centrifugeringsomgångar. För att isolera bakterier från mikrobiella mattor rekommenderar Bey et al. (10) till exempel inte bara centrifugering vid 500×g i 15 minuter, utan även att sedimentet åter suspenderas och att proceduren upprepas fyra gånger. För att isolera bakterier från jord rekommenderar Bakken (9) på samma sätt upprepad centrifugering (ett ”antal gånger”) av provets homogenat vid 630-1060×g (under en ospecificerad tid), följt av resuspension och återhomogenisering. Liknande metoder har också föreslagits för att isolera bakterier från ”positiv” blododlingsbuljong. För att få fram rena isolat av bakterier innan deras identitet bestämdes med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri använde Stevenson et al. (11) ett centrifugeringsförfarande i flera steg som innebar sekventiella centrifugeringssteg i ”1-2 minuter” vardera vid 8 500, 1 000 och 13 000 varv per minut (värdet i g inte specificerat) med resuspension av pelletsen i olika buffertar vid varje steg.

Dessa citerade protokoll är ingalunda de enda exemplen på ad hoc-centrifugeringsprotokoll som kännetecknas av ett till synes godtyckligt val av centrifugeringshastigheter och/eller -tider. En viktig konsekvens av sådana ad hoc-protokoll är att de inte ger någon rationell grund med vilken andra kan utforma protokoll för att isolera olika målceller från andra matriser/cellblandningar. Det är t.ex. intuitivt uppenbart att långvarig centrifugering leder till att alla partiklar sedimenterar, medan centrifugering under kort tid endast sedimenterar de snabbaste partiklarna och lämnar kvar de flesta långsammare partiklarna i suspensionen. Att bestämma den optimala hastigheten/durationen för centrifugeringen för att isolera målpartikeln samtidigt som andra partiklar avlägsnas är dock fortfarande en konst. Med andra ord ger de för närvarande rapporterade protokollen inte en rationell grund för modifiering (bestämning av optimal centrifugeringshastighet/tid) för andra relaterade separations-/isoleringsmål.

Material och metoder

Teori

Vår föreslagna metod för att separera två partikeltyper som har liknande tätheter, men olika sedimenteringshastighet på grund av storleksskillnader, illustreras i figur 1. I början av processen (figur 1(1)) laddas suspensionen (blododlingsbuljong, i vårt fall) som innehåller separanderna (vita blodkroppar eller WBC, röda blodkroppar eller RBC, trombocyter och bakterier) som ett separat skikt ovanpå en klar tät buffert (Histopaque 1083, i vårt fall). Buffertens densitet är större än WBC:s (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) och trombocyter (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), men lägre än RBC:s (ρ = 1,1 g/mL (14)) och bakterier (ρ = 1,105 g/mL för Escherichia coli (15)). När centrifugeringen fortskrider drivs alla partiklar nedåt, först genom det översta lagret (blododlingsmediet) och sedan ner i den täta bufferten (histopaken). Medan partiklar med högre densitet än buffertens (RBC och bakterier) sedimenterar genom både blododlingsbuljongen och den täta bufferten, utesluts mindre täta separander (WBC och trombocyter) från den senare. Denna process liknar det protokoll som rekommenderas för att separera WBC och trombocyter från helblod (16). För vårt syfte är dock enbart denna process otillräcklig, eftersom vissa oönskade partiklar (WBC och trombocyter) avlägsnas från målpartiklarna (bakterier) på grundval av densitetsskillnader, medan andra partiklar med liknande densitet (RBC) kvarstår. För att uppnå vårt mål att samla in alla målceller (bakterier) samtidigt som alla återstående oönskade partiklar (RBC) avlägsnas, föreslår vi att systemet förs till det tillstånd som visas i figur 1(4) och att centrifugeringsprocessen stoppas där. I detta tillstånd deponeras alla röda blodkroppar, som på grund av sin större storlek har en högre sedimenteringshastighet, i botten av röret som en pellet, medan alla bakterieceller sprids i den täta bufferten.

För att nå detta önskade tillstånd måste dock ett antal begränsningar uppfyllas. För det första måste vi, för att se till att alla bakterier samlas upp i bufferten, ge tillräckligt med tid åt de bakterier som började i toppen (plan A) att vandra genom skiktet av blododlingsbuljong (medium 1) och in i Histopaque (medium 2). Matematiskt innebär detta att:

där t är den tid som centrifugeringsprocessen pågår, l1 är längden på den laddade kolonnen med blododlingsbuljong och vb1 är sedimentationshastigheten för bakterierna i detta lager. Denna tidpunkt (när bakterier som börjar på plan A just har passerat plan B och kommer in i bufferten) visas i figur 1(2).

En annan framträdande egenskap hos detta tillstånd är att bakterierna och de röda blodkropparna kanske inte har bildat distinkta ”band” i bufferten vid denna tidpunkt. Medan RBC som börjar på ett givet horisontellt plan vandrar längre än bakterier som befinner sig på samma plats, har RBC som började på plan A kanske inte gått om bakterier som började på plan B (gränssnittet mellan de två vätskorna). För att detta skall ske och för att RBC och bakterier skall bilda skilda band i bufferten måste buffertkolonnen vara tillräckligt lång. Det kommer inte att vara möjligt att bilda skilda band om buffertpelaren till exempel bara sträcker sig så djupt som den nivå som visas av den streckade linjen i figur 1(2). Matematiskt sett kan villkoret att de röda blodkroppar (partiklar med snabbare sedimentering) som startar på plan A ska hinna förbi bakterierna (partiklar med långsammare sedimentering) som startar på plan B uttryckas på följande sätt:

där l1 och l2 är längden på kolumnerna med blododlingsbuljong (medium 1) respektive buffert (medium 2), vR1 och vR2 är sedimenteringshastigheten hos de röda blodkropparna i buljongen respektive bufferten och vb2 är sedimenteringshastigheten hos bakterierna i bufferten. Ovanstående ekvation kan omformas till följande:

Det vore dessutom önskvärt att alla bakterier som ursprungligen fanns i medium 1 samlas in i medium 2. Detta innebär att när de bakterier som börjar i toppen (plan A) passerar gränssnittet mellan de två faserna (plan B) får de som börjar i plan B inte ha nått botten när de börjar i plan B. Matematiskt uttrycks detta villkor som:

där vb1 är sedimentationshastigheten för bakterierna i medium 1. Ovanstående kan omformas till:

Om ekvationerna (3) och (5) är uppfyllda kommer systemet att nå det tillstånd som visas i figur 1(4) där alla röda blodkroppar har nått rörets botten och bildar ett separat lager, men ingen av bakterierna har gjort det. (De befinner sig alla i medium 2). Detta tillstånd uppstår först när alla RBC (även de som börjar på plan A) har nått rörets botten. Matematiskt kan detta ögonblick i tiden (t1) representeras som:

Tillståndet upphör att existera när bakterierna (de som ursprungligen fanns vid gränssnittet dvs. vid plan B) börjar nå botten av röret. Tiden då detta inträffar (t2) ges av:

För att få bästa möjliga separation måste man alltså (i) se till att kolonnlängderna för de två medierna uppfyller ekvationerna (3) och (5), och (ii) att varaktigheten under vilken sedimenteringsprocessen körs (tcentrifugering) ges av:

Fortsätter centrifugeringen längre än t2 kommer det att resultera i den situation som visas i figur 1(5), där en del eller alla bakterier också sedimenterar till botten. För att få rena isolat av de önskade arterna måste centrifugeringsprocessen stoppas i det skede som motsvarar figur 1(4), det övre lagret kasseras och den täta bufferten tas upp utan att sedimentet i botten störs. Om så önskas kan målpartiklarna centrifugeras och resuspensioneras i andra medier.

Detta ”operationsfönster” mellan t1 och t2 avbildas schematiskt i figur 2. Här visar abscissan centrifugeringstiden, medan ordinatan visar den fraktion av RBC- och bakteriepartiklar som finns i den täta bufferten (medium 2). För båda ökar fraktionen till en början när de vandrar in från det översta lagret, förblir konstant under en viss tid när de vandrar som ett band genom den täta bufferten och minskar slutligen när de lägger sig i botten. RBC som rör sig snabbare har en brantare lutning för uppgång/nedgång samt en kortare period när alla är närvarande i den täta bufferten. Under ”driftsfönstret” (molnig ruta) finns praktiskt taget alla bakterier (∼100 %) i bufferten, men praktiskt taget inga RBC (∼ 0 %).

RBC:s och bakteriernas sedimentationshastigheter (som bestämmer de numeriska värdena för de begränsningar som ges av ekvationerna 3, 5 och 8) kan förutsägas på grundval av deras respektive former, storlekar och tätheter. Sedimentationshastigheten för ges (17) genom ekvationen:

där ρ och ρl är partikelns respektive vätskans densitet, µ är vätskans viskositet, R är partikelns effektiva radie och g är accelerationen på grund av gravitation/centrifugering. E. coli är stavformade bakterier som är 2 mikrometer långa och har en diameter på 0,5 mikrometer (18). Därför kan vi modellera dem som prolata sfärer, vars effektiva sedimentationsradie (R) ges (19) av:

där a och b är halva längden på den stora och lilla axeln. För E. coli är a = 1 mikrometer och b = 0,25 mikrometer. Baserat på dessa värden förväntar vi oss att E. coli har en sedimentationshastighet på 26,7 mikrometer/sekund genom den övre vätskan och en hastighet på 6,56 mikrometer/sekund genom den Histopaque 1083.

Å andra sidan är mänskliga RBC bikonkava skivor med en diameter på 7-8 mikrometer och en tjocklek på 2 mikrometer (20). De kan därför modelleras som oblata sfärer vars effektiva sedimentationsradie ges (19) av:

där a och b är halva längden på stor- respektive liten axel. Med värden på 4 mikrometer för a och 1 mikrometer för b förutspår vi att när de utsätts för centrifugering med hjälp av vårt instrument, en Eppendorf-5804, vid en relativ centrifugalkraft på 400×g, kommer RBC att sedimentera med en hastighet på 500 mikrometer/sekund genom det översta lagret med densitet ∼1.02 g/mL (enligt våra mätningar) och 101 mikron/sekund genom Histopaque (densitet = 1,083 g/mL).

Partiklars sedimenteringshastighet kan förutsägas mer exakt genom att ta hänsyn till partikel-partikelinteraktioner. Dessa partikel-partikelinteraktioner uppstår när vätska som förskjuts uppåt av en sedimenterande partikel påverkar andra partiklar omedelbart bakom eller bredvid den första, vilket gör att de senare utsätts för ett ökat vätskemotstånd och därmed minskar den effektiva (genomsnittliga) sedimenteringshastigheten för partiklarna som grupp. Detta fenomen kallas ”hindrad sedimentering” och måste beaktas när partiklarnas volymfraktion inte är försumbar. Det finns ett antal semianalytiska eller empiriska uttryck för att beräkna effektiva sedimentationshastigheter för system med hindrad sedimentation (21). Ett sådant tillvägagångssätt är Richardson-Zaki-korrelationen, där den effektiva sedimenteringshastigheten (v′) ges av följande:

där v är partikelns sättningshastighet i det obehindrade fallet och φ är partiklarnas volymfraktion. Blod späds vanligen ut i blododlingsbuljong med en spädning på 1:4 (22). Eftersom hematokriten (volymfraktionen av röda blodkroppar i blod) vanligtvis är omkring 0,4-0,45 (23) är den resulterande volymfraktionen av röda blodkroppar i vårt prov omkring 0,1. Om detta beaktas med hjälp av ekvation 12 är de beräknade sedimenteringshastigheterna för RBC i medium 1 och 2 307 mikrometer/sekund respektive 62 mikrometer/sekund. När blododlingar blir positiva innehåller de dessutom ∼108 CFU (colony forming units) (celler) av bakterier per ml suspension (24). På grund av deras ringa storlek (radie ∼1 mikrometer) förblir deras volymfraktion dock mindre än 0,001, och effekten av ”hindrad sedimentering” kan försummas.

Med en provvolym från vilken man vill isolera den eller de aktuella celltyperna kan flödesschemat i det kompletterande materialet (kompletterande figur 1) användas för att vägleda valet av sedimenteringsbuffert, förutsäga sedimenteringshastigheterna för de aktuella cellerna i denna buffert, bestämma den lämpliga volymen (kolonnlängden i det tillgängliga centrifugeringsröret) som ska användas och slutligen beräkna den optimala centrifugeringstiden (driftsfönstret) med hjälp av den eller de centrifuger som är tillgängliga. För vårt system (5 ml ”positiv” blododlingsbuljong lastad i 15 ml centrifugeringsrör) sammanfattas processen i tabell 1.

Tabell 1. Teoretiska förutsägelser av minsta kolonnlängder och minsta/maximala driftstider.

Experimentell validering

Vi förberedde först en syntetisk ”positiv blododlingsbuljong” genom att i 8 ml BACTEC Ped-Plus-medium (Becton Dickinson, Sparks, MD) dispergera 2 ml färskt blod (från en frivillig person) och 0.1 ml av en suspension som innehåller ∼104 CFU (celler) per ml E. coli K-12 och inkubera blandningen i en nötningsblandare vid 37 °C över natten (12-14 timmar) för att erhålla en suspension som innehåller ∼109 blodkroppar/mL och 108 CFU/mL bakterier. 1,5 mL av buljongen togs i ett mikrocentrifugeringsrör (Eppendorf, New York, USA) och cellerna ”pelleterades” ut genom centrifugering. Supernatanten drogs ut och massan av 1 ml mättes med hjälp av en våg (OHaus® GA-110) för att uppskatta densiteten av vätskan i buljongen.

Också 5 ml av den positiva blododlingsbuljongen lastades ovanpå 5 ml Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Flera sådana rör laddades i en Eppendorf-5804 bänkcentrifug och centrifugerades under olika lång tid (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min och 90 min). I slutet av centrifugeringsprocessen avlägsnades röret försiktigt, det översta skiktet (blododlingsbuljong) kastades, medan det histopaka skiktet samlades upp utan att sedimentet i botten (om det fanns) stördes. Koncentrationen av bakterier i den uppsamlade vätskan bestämdes med hjälp av standardmetoder som omfattar serieutspädning, utläggning på Tryptic Soy Agar, inkubation och koloniräkning (25). Koncentrationer av röda blodkroppar erhölls genom att undersöka en alikvot av provet i en hemocytometer under mikroskop (26).

Resultat och diskussion

Resultaten sammanfattas i figur 3. Linjerna representerar det teoretiska antalet blodceller eller bakterier som förväntas finnas i Histopaque-skiktet (minus sedimentet i botten) baserat på våra teoretiska förutsägelser. De heldragna symbolerna representerar genomsnittet av minst tre avläsningar av det observerade antalet blodkroppar (kvadrater) och E. coli (diamanter). Felstaplarna är standardavvikelsen.

Som framgår av figur 3 stämmer det observerade beteendet kvalitativt överens med våra förutsägelser; för båda täta partiklar (RBC och bakterier) stiger koncentrationerna i Histopaque till en början med tiden för att sedan förbli konstanta under en viss tid för att slutligen minska. Det konstaterades dock att för RBC:erna sker hela processen (ökning, stabilt tillstånd och minskning) något långsammare än vad som förutspåddes. Effekten av denna något lägre sedimentationshastighet påverkar lyckligtvis inte vårt operationsfönster eftersom fönstrets början styrs av den tid som behövs för att alla bakterier skall komma in i den täta bufferten. När detta sker är koncentrationen av röda blodkroppar i den täta bufferten försumbar. Med andra ord ser man att det operationsfönster som förutses av våra modeller (∼20 min till ∼75 min) håller.

De vanligaste förekommande bakterierna är också ganska små (∼1 mikrometer i karakteristisk längd) och deras tätheter är likartade. (t.ex. 1,1 g/mL för Pseudomonas (27), 1,13 g/mL för Streptococcus (28) och 1,135 g/mL för Bacillus (29)). Det är därför troligt att de har en sedimentationshastighet som är jämförbar med E. coli i både blododlingsbuljong och Histopaque-1083, och följaktligen bör operationsfönstret också vara likartat. Även om vårt operationsfönster (∼20 min till ∼75 min) endast gäller för vår hårdvara och våra experimentella parametrar, ger vår teoretiska analys en grund för att förutsäga andra operationsfönster, inte bara i syfte att isolera bakterier från positiva blododlingsbuljonger med hjälp av olika hårdvara, utan även för att isolera andra målceller från olika matriser med hjälp av täta buffertar. Denna metod kan också användas på ett sekventiellt sätt för att isolera ett mål från en blandning som innehåller både arter med snabbare sedimentering och arter med långsammare sedimentering. I sådana fall skulle man använda vår metod för att först eliminera alla arter som rör sig snabbare och därefter använda den för att samla in den snabbast sedimenterande målarten i den återstående blandningen.

.