Djur
C57BL/6J-djur köptes från Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) och föddes upp i huset. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) och Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) köptes från Jackson Laboratory. Linjen Vgat-Cre (VgatCre) har tidigare genererats68. Alla Cre-linjer avlades på C57BL/6J-bakgrund i minst en generation. Djuren hölls i Institute of Neuroscience djuranläggning på 12 h:12 h ljus/mörkcykel med mat och vatten ad libitum. Endast heterozygota djur med Cre-alleler användes i studien. Alla experimentella protokoll godkändes av Animal Care and Use Committee of the Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina (IACUC No. NA-016-2016).
Kirurgi
Vuxna möss, 2-4 månader gamla, sövdes med isofluran (0,8-5 %) och placerades i en stereotaktisk ram (David Kopf Instrument, Model 1900). Ögonsalva applicerades för att förhindra uttorkning. Skallen exponerades med ett litet snitt och hål borrades för att injicera virus med glaspipetter (15-25 μm i diameter vid spetsen) och för att implantera optiska fibrer. Koordinaterna för virustillförsel till mPOA var AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (Paxios och Franklins mushjärnatlas, andra upplagan). 100-400 nl virus injicerades per sida med en flödeshastighet på 70 nl per minut med hjälp av en hemmagjord nanoliterinjektor eller med 40 nl per minut med hjälp av en hydraulisk pump (Harvard Apparatus). Glaspipetter lämnades på plats i ca ~10 min efter injektionen innan de drogs tillbaka. Monooptiska fibrer (diameter, 200 μm; N.A., 0,37; längd, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) eller dubbla optiska fibrer (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT; Doric Lense) placerades 400 μm ovanför virusinjektionsstället för optogenetiska experiment eller 50 μm ovanför för fiberfotometriinspelningar. Optiska fibrer fästes med tandcement och skallskruvar. Kattkamrater valdes slumpmässigt ut för att injiceras med antingen experimentellt virus eller kontrollvirus. Kastrationsoperationer utfördes med djur som sövdes med intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin (80 mg kg-1) och xylazin (8 mg kg-1). Djuren fick 3-4 veckor på sig att återhämta sig efter operationerna före efterföljande beteendetester.
Virus
Behavioral assays
Alla beteendetester påbörjades minst en halvtimme efter mörkercykelns början och registrerades med hjälp av en infraröd kamera med en bildfrekvens på 25 Hz och poängsattes av försöksledare som var blinda för genotyp, gruppinformation eller fotostimuleringsstatus hos de berörda djuren. Alla djur som testades för beteenden, utom de som användes i optogenetiska hämningsexperiment, var naiva jungfruliga möss före testet. I försöken med optogenetisk hämning var alla hanmöss sambos med honmöss och en del av dem blev fäder före försöken, medan en del honor sambos med valpar, parades för att bli mödrar eller behandlades med veckors testosteroninjektion före försöken. Med undantag för djur som användes i optogenetiska aktiveringsexperiment var alla djur enskilt inhysta 3-7 dagar före beteendetestning.
För parningsbeteendetestningar introducerades en hormonellt primat ovariektomerad C57BL/6-hona i hemmaburen och videofilmades i 30 minuter. Parningsbeteendetesterna upprepades tre gånger med olika stimulusdjur med minst tre dagars mellanrum. Föräldrabeteendet testades genom att tre ungar i åldrarna P1 och P4 spreds ut i utkanten av boet och videofilmades i ~15 minuter och upprepades 2-3 gånger. Territoriell aggression testades genom att introducera en inkräktande mus av Balb/c-färg köpt från Slac Laboratory Animal (Shanghai) till det testade djurets hembur och videofilma i ~15 min.
Videos kommenterades manuellt bild för bild med hjälp av ett skräddarsytt MATLAB-program enligt tidigare beskrivning8. Beteenden poängsattes enligt följande kriterier: Kontakter från näsa till ansikte, från näsa till kropp eller från näsa till örogenital som initieras av de testade djuren poängsätts kollektivt som ”social utredning”, varav kontakt från näsa till örogenital specifikt definieras som ”kemoundersökning”, även känd som ”sniffning”. ”Mount” poängsätts när försöksdjuret placerar sina framben på stimulansens rygg, klättrar upp på den och rör bäckenet. Rytmiska bäckenrörelser efter uppstigning poängsätts som ”Pelvic thrust”. Handlingar som initieras av det bofasta djuret mot en manlig inkräktare, t.ex. utfall, bett och tumlande, poängsätts som ”Attack”. ”Valpkontakt” poängsätts när ett djur har kontaktat en valp med nosen eller munnen. ”Hämtning av valp” poängsätts när ett djur håller kvar valpen med munnen och rör sig, vanligen mot boet. ”Huka” poängsätts när djuret böjer ryggen och svävar över valparna i boet. Valparna inspekterades alltid efter beteendestudien för att upptäcka eventuella sår. Ungefär 2 % av beteendeförsöken resulterade i skadade valpar. Uteslutande av dessa försök påverkade inte någon slutsats.
Optogenetisk aktivering
Djur som användes för optogenetiska experiment var grupphållna. På dagen för beteendetestet fördes de in i en ny bur. En extern optisk fiber användes för att ansluta en 473 nm laserkälla (Shanghai Laser and Optics Century Co. eller Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) till den implanterade optiska fibern i djuret. Den externa optiska fibern var fäst vid en roterande led (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) för att djuret skulle kunna bete sig fritt. Det testade djuret fick utforska buren i ~15 minuter med den externa fibern fastsatt. Därefter startades ett anpassat MATLAB-program för att styra en Master 9 (A.M.P.I.), som skickade en utlösare för att påbörja inspelning från kameran och signaler till lasern för att leverera 15 s fotostimulering vid 40 Hz 12 mW eller 20 Hz 5 mW, med slumpmässiga intervaller på 90-120 s mellanrum. Lasereffekten justerades för varje djur i enlighet med den implanterade optiska fiberns luminansöverföringseffektivitet som uppmättes före implantationen för att säkerställa effekten av det ljus som sänds ut vid fiberns spets. Under laserstimuleringen testades djuren antingen ensamma för lokomotion eller tillsammans med en hormonellt primat ovariektomerad hona, en C57BL/6-hane, en ung råtta i åldern P13-P15, valpar i åldern P1-P4 eller gummiblock av liknande storlek som valparna som stimulus. Fem-tolv stimuleringar gavs under varje försök. Ett-fyra försök med varje stimulans (med 3-5 minuters mellanrum) utfördes varje dag för varje djur. Efter att alla beteendetester avslutats gavs djuren tåg av ljusstimulering (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 gånger, fast 105 s intervall) och perfunderades transkardialt med 4 % paraformaldehyd en timme efter ljusstimuleringen för histologisk analys. Blod togs också vid tidpunkten för avlivning för hormonella mätningar.
Fiberfotometri
Djuren som användes för fiberfotometriexperiment var enskilt inhysta 3-7 dagar före beteendetestning. Under testdagen var den implanterade optiska fibern ansluten till F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Beijing), en integrerad inspelningsuppställning för fiberfotometri, via en extern optisk fiber. I F-scope reflekteras en 488 nm excitationslaser (OBIS 488LS; Coherent) från en dikroisk spegel (MD498, Thorlabs). Emissionssignalerna som samlas in genom den implanterade optiska fibern filtreras med ett bandpassfilter (MF525-39, Thorlabs) och leds till ett fotomultiplikatorrör (PMT, R3896, Hamamatsu). Under registreringarna justerades lasereffekten för varje djur i enlighet med den implanterade optiska fiberns luminanstransitivitetseffektivitet för att säkerställa att det ljus som sändes ut vid fiberns spets var ~30 μw och PMT:s spänningsförstärkning ställdes in på 500 v för GCamp6s-djur och 300-350 v för kontrolldjur. När det väl hade startat skickade F-scope-programvaran en utlösarsignal för att inleda videoinspelning från den infraröda kameran. Emissionssignalerna lågpassfiltrerades vid 30 Hz och samplades vid 500 Hz med ett datainsamlingskort (USB6009, National Instrument) med hjälp av en programvara som tillhandahålls av Biolink Optics. För ett givet försök fick djuren först utforska i ~5 minuter, under vilken tid baslinjesignaler registrerades. Därefter introducerades ett stimulus, t.ex. en hormonellt förberedd ovariektomiserad hona, en fejkad musleksak i plast, ungar i åldern P1-P4 eller gummiblock av liknande storlek som ungar. Djuren tilläts interagera och bete sig med stimuli i 15-90 min innan stimuli avlägsnades, varefter signaler registrerades i ytterligare ~5 min.
Optogenetisk hämning
Djuren som användes för optogenetiska hämningsexperiment var enkelstammiga. Hanmöss samhystes med honor för att få sexuell erfarenhet eller för att bli pappor före testerna. Jungfruliga honmöss testades som naiva djur för manligt typiska parningsbeteenden och moderbeteenden. I de fall då de hade ett dåligt grundläggande moderbeteende under det första testet, samhystes de med valpar över natten och testades på nytt för moderbeteende. Efter testning av moderbeteende behandlades vissa honor varannan dag med subkutan injektion av testosteron (100 μg i 50 μl solrosolja, Shanghai Pharm.) i cirka tre veckor innan de återigen testades för hane-typisk parning. Honor som testades som mödrar parades efter virusinjektion för att producera egna valpar.
För beteendetestet användes en dubbel fiberoptisk patchcord (DFP_200/230/900-0.37_1m_DF0.9_2FCM, Doric Lense) för att koppla in en 473 nm laserströmkälla (Shanghai Laser and Optics Century Co. eller Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) till den implanterade dubbla optiska fibern (DFC_200/245-0.37_6.0mm_DF0.9_FLT, Doric Lense) i djuret via en roterande led (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0.22, Doric Lense) för att låta djuret bete sig fritt. Efter ~10 minuters boende utlöstes kameran för att registrera beteendeprocessen genom en signal som skickades från Master 9, som styrdes av ett specialskrivet MATLAB-program. För att leverera ljus efter att ha närmat sig, utlöstes ljuset (~12 mW) automatiskt för att levereras kontinuerligt så länge som det testade djurets positioner upptäcktes av programmet att det befann sig inom en kroppslängd från den hormonellt primade ovariektomerade honan i parningsbeteendetester eller inom valpområdet, vilket definierades genom att markera ett något större område som omger varje utspridd valp i moderbeteendetesterna. Minst två ljusförsök och två försök utan ljus utfördes alternativt för varje test. För att ge ljus efter initiering av definierade beteenden utlöstes blått ljus (~12 mW) av fast längd (5 eller 10 s) manuellt när experimenten observerade det beteende som var intressant i realtid. Ett eller två ljusförsök utfördes alternativt för varje test.
Fluorescerande immunfärgning
Djuren sövdes med 10 % kloralhydrat och transkardialt perfunderades med PBS följt av iskall 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS. Därefter sektionerades hjärnorna i 40 μm tjocklek med hjälp av en vibratom (VT1000S, Leica). Sektionerna delades jämnt upp i flera uppsättningar och bearbetades för färgning eller monterades direkt. Hjärnsektionerna blockerades i 5 % getserum i AT (0,1 % Triton och 2 mM MgCl2 i PBS) i 1 timme i rumstemperatur och inkuberades över natten vid 4 °C i AGT (0,5 % normalt getserum, 0.1 % Triton och 2 mM MgCl2 i PBS) innehållande lämplig primär antikropp (kanin anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; kanin anti-Esr154, 1:10 000, Millipore, Cat# 06-935). Nästa dag tvättades hjärnsektionerna med AGT tre gånger (30 minuter vardera) och inkuberades med lämpliga sekundära antikroppar (Alexa Fluor 488-konjugerad, 1:1000; Cy3-konjugerad, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) i rumstemperatur i 2 timmar. Hjärnsektionerna kontrafärgades med Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) eller DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) i AT. Efter flera tvättar i AGT, AT och PBS monterades hjärnsektionerna på glasobjektsglas.
DAB-färgning
Hjärnsektioner förbereddes på samma sätt som vid fluorescerande immunfärgningsexperiment och förbehandlades med 3 % H2O2 i 30 minuter i rumstemperatur för att blockera det endogena peroxidaset, tvättades två gånger i 10 minuter vardera i PBST (0.3% Triton X-100 i PBS), blockerades med 5% getserum i PBST i 2 timmar i rumstemperatur och inkuberades med primär anti-c-Fos-antikropp (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) i PBST över natten vid 4 °C. Nästa dag tvättades sektionerna sex gånger i PBST, 10 minuter vardera, och inkuberades sedan med biotinkonjugerad sekundär antikropp mot get-antiklabb (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) i PBST i 2 timmar i rumstemperatur. Efter tre tvättar i PBS, 5 minuter vardera, färgades hjärnsektionerna med VECTASTAIN® ABC-reagens i 30 minuter enligt tillverkarens manual. Efter två tvättar på 5 minuter i PBS inkuberades hjärnsektionerna i 3,3-diaminobenzidinlösning (Cat# D5637-5G, Sigma) med nickelintensifiering tills önskad färgningsintensitet uppnåddes. Reaktionen stoppades genom att skölja sektionerna i kranvatten. Hjärnsnitt monterades på glasobjektiv och fångades under ×4- eller ×10-objektiv med konventionella ljusmikroskop.
In situ-hybridisering
DNA-mallar för att generera in situ-prober klonades med hjälp av följande primeruppsättningar för varje motsvarande gen: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ och 5′-agcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactactagtccaaatctcttacggtgctacctcctc-3′ och 5′-atcgctcgagtagccatctttcctgttttccact-3′; Cre, 5′-ccaatttactgaccgtacacca-3′ och 5′-tatttacattggtccagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgaggagagagagaggttg-3′ och 5′-agagaagagagcgaaggctact-3′; Galanin, 5′-atcctgcactgaccagccagcc-3′ och 5′-ttggcttgaggagggggc-3′. Anti-sense RNA-prober transkriberades med T7 RNA-polymeras (Promega, Cat# P207E) och digoxigenin (DIG)-märkta nukleotider. Djuren sövdes med 10 % kloralhydrat och transkardialt perfunderades med DEPC-behandlad PBS (D-PBS) följt av iskall 4 % paraformaldehyd (PFA) i D-PBS. Därefter sektionerades hjärnorna i 40 μm tjocklek med hjälp av en vibratom (VT1000S, Leica). Hjärnsektionerna tvättades i 2XSSC-buffert innehållande 0,1 % triton i 30 minuter, acetylerades i 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) med 0,25 % ättiksyraanhydrid (vol/vol) i 10 minuter, ekvilibrerades i förhybridiseringslösning i 2 timmar vid 65 ℃ och inkuberades därefter med 0,5 μg ml-1 av specifika RNA-prober i hybridiseringsbuffert över natten vid 65 ℃. Nästa dag sköljdes sektionerna i för-hybridiseringslösning och för-hyb/TBST (TBS med 0,1 % tween-20) i 30 minuter vardera. Därefter tvättades sektionerna med TBST två gånger och TAE tre gånger, var och en i 5 minuter. Sektionerna överfördes sedan till brunnar i 2 % agarosgel, som kördes i 1XTAE vid 60 V i 2 h för att avlägsna ohybridiserade prober. Sektionerna tvättades sedan två gånger i TBST och inkuberades därefter med får-anti-digoxygenin-AP (1:2000, Roche, kat. 11093274910), ibland tillsammans med kanin-anti-Esr1-antikropp (1:3000, Millipore, kat. 06-935) för samfärgning, i 0,5 % blockeringsreagens (Roche, 11096176001) vid 4 °C över natten. Den andra dagen tvättades sektionerna för ljusfältsfärgning och färgades med NBT (Roche, kat nr 11383213001) och BCIP (Roche, kat nr 11383221001) under 4-10 timmar vid 37 ℃. För fluorescerande in situ-hybridisering i kombination med immunohistokemi färgades sektionerna först med fluorescerande sekundära antikroppar, följt av färgning med fast red (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) och motfärgning med DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) i PBS. Alla sektioner tvättades efter färgningen och monterades på glasplattor. Bilderna togs med ×20 objektiv med ett konventionellt eller konfokalt mikroskop.
catFISH
De flesta djur som användes i catFish-experimentet var erfarna. För förfarandet fick djuren två episoder på 5 minuter av social interaktion med en hormonellt primat ovariektomerad hona eller utspridda ungar, med 30 minuters mellanrum. Omedelbart efter den andra episoden sövdes djuren med 10 % kloralhydrat och transkardialt perfunderades med DEPC-PBS följt av iskallt 4 % PFA i PBS. Hjärnorna dissekerades och postfixerades över natten vid 4 °C och dehydratiserades med 30 % sackaros i DPEC-PBS. Därefter sektionerades hjärnorna i 20 μm tjocklek och monterades på SuperFrost Plus®-objektsglas (Fisher Scientific, kat. nr 12-550-15). Efter torkning i luften förvarades objektglasen i -80 °C innan de bearbetades i enlighet med RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 User Manual (ACD Bio.). Probes mot c-Fos intron, c-Fos mRNA och Esr1 beställdes från ACD Bio. och användes i experimentet. Bilderna togs under ett ×60-objektiv med hjälp av ett konfokalmikroskop.
Elektrofysiologiska registreringar
C57BL/6-djur som injicerats med AAV som kodar för ChR2-mCherry i mPOA eller Esr1Cre-möss som injicerats med AAV som kodar för GtACR1 sövdes med isofluran och transkardialt perfunderades med iskall syresatt (95 % O2/5 % CO2) högsackaroslösning (sammansättning i mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 sackaros, 26 NaHCO3). Efter dissektion av hjärnan skars koronala snitt inklusive mPOA på 250 μm med hjälp av en vibratom (VT-1200S, Leica) i iskall syresatt snittlösning. Hjärnskivorna inkuberades sedan i artificiell cerebrospinalvätska (ACSF; sammansättning i mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glukos, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) vid 34 °C i minst 1 timme och registrerades vid rumstemperatur. Cellerna identifierades i fluorescerande mikroskop och visualiserades med infraröd differentiell interferenskontrast (BX51, Olympus). Hela cellens strömklämningsinspelningar utfördes med en MultiClamp700B-förstärkare och Digidata 1440A-gränssnitt (Molecular Devices). Patch-clamp-elektroden (5-8 MΩ) fylldes med en intracellulär lösning (sammansättning i mM: 120 K-glukonat, 4 KCl, 10 HEPES, 10 natriumfosfokritin, 4 Mg-ATP och 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). För optogenetisk aktivering gavs blått ljus (473 nm, 10 ms bredd, 14 mw mm-2, 40 pulser) på skivorna genom ett ×40-objektiv med hjälp av en X-Cite LED-ljuskälla (Lumen Dynamics). Spikfideliteten i ChR2-uttryckande neuroner mättes genom att räkna antalet ljuspulser som framgångsrikt framkallade aktionspotentialer vid olika frekvenser. Spike fidelity var ett medelvärde över fem stimuleringar och ritades ut. För optogenetisk hämning inducerades aktionspotentialen hos GtACR1-uttryckande neuroner genom att hålla membranpotentialen -48 mW med en ströminjektion och upprepat kontinuerligt blått ljus levererades på skivor.
Kalciumavbildning i hjärnskivor
AAV:er som kodar för ChR2 och AAV:er som kodar för GCamp6s, båda drivna av hSyn, saminjicerades i mPOA hos C57BL/6 djur. Akuta hjärnskivor inklusive mPOA preparerades på samma sätt som de elektrofysiologiska förfarandena som beskrivs ovan. Kalciumavbildning utfördes med hjälp av ett tvåfoton laserskanningsmikroskop (Ultima, Prairie Instruments Inc.) med ett 20X/0,95-NA XLUMPLFL vattenimmersionsobjektiv (Olympus). Ti:safirlasern var inställd på 940 nm och bilder med en storlek på 512 × 512 pixlar förvärvades genom 525/70 nm emissionsfilter med en bildfrekvens på 1,2 Hz. Randomiserade tåg av 470 nm-ljus (10 ms puls, 15 s, 8,4 mW mm-2) med olika frekvenser (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) levererades till skivorna med intervaller på ~2 min. Bilderna analyserades med ImageJ.
Hormonanalyser
Rumpblod samlades in vid tidpunkten för avlivning före perfusion. Serum framställdes. Hormontitrar analyserades med hjälp av ett testosteron ELISA-kit (DRG Instruments GmbH, Tyskland, Division of ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) enligt tillverkarens protokoll.
Dataanalys
Alla koder skrevs i MATLAB och användes för dataanalysen, och är tillgängliga på begäran. Ingen beräkning av urvalsstorlek utfördes. Antalet celler som registrerades i skivan eller räknades vid färgning och antalet djur som användes för beteendetester och färgning valdes i enlighet med publicerad litteratur om liknande experiment. Datapunkter från djur som vid en histologisk analys i efterhand ansågs vara felaktiga träffar enligt på förhand fastställda kriterier uteslöts från analysen. Sammanlagt uteslöts tre Esr1Cre-honmöss och en Esr1Cre-hane som injicerats med GtACR1, en VgatCre-hane och en VgatCre-hona samt en Esr1Cre-hona som injicerats med Casp3 från analysen.
För att analysera data från Ca2+-avbildningsexperiment i hjärnskivor kvantifierades bilderna i ImageJ. Kortfattat beskrevs GCaMP6s+-celler manuellt och de relativa fluorescensförändringarna (ΔF/F) beräknades för varje cell med ekvationen ΔF/F = (F-F0)/F0, där F0 är den genomsnittliga pixelintensiteten i de sista 10 bildrutorna före ljusstimuleringen och F är den genomsnittliga pixelintensiteten i de första 6 bildrutorna efter ljusstimuleringen. Bilder som togs under fotostimuleringsperioderna uteslöts från analysen. En aktiverad cell definierades operativt som celler som visade en ökning av ΔF/F som var 5 standardavvikelser från de genomsnittliga ΔF/F-värdena som uppmättes i 30 bilder före den första fotostimuleringen.
För att analysera ljusframkallad rörelse extraherades först rörelsespåren med hjälp av anpassade MATLAB-koder som känner igen djurets centroid. Rörelsehastigheten beräknades sedan i tidsbins på 1 s genom att mäta den tillryggalagda sträckan. De 15 datapunkterna för rörelsehastighet under en fotostimuleringsperiod jämfördes med tidigare 15 punkter för att testa om den ljusstimuleringen inducerade en hastighetsökning i det försöket. På djurnivå jämfördes genomsnittet av rörelsehastigheterna under varje fotostimuleringsperiod med genomsnittet av rörelsehastigheterna omedelbart före varje fotostimuleringsperiod för att avgöra om den ljusinducerade rörelsen ökar hos det djuret. För optogenetiskt inducerad montering och hämtning av ungar bedömdes videorna först blint. Videoprotokollet anpassades sedan till fotostimuleringsprotokollet för att få fram försöksprocent, startlatens och den totala varaktigheten för framkallade beteenden. Endast beteenden som inträffade under ljusstimulering räknades som optogenetiskt inducerade beteenden. Om ett beteende inträffade före men ändå pågick under en fotostimuleringsperiod, räknades det inte som optogenetiskt inducerat beteende. Parametrarna medelvärdesberäknades alltid över fotostimuleringsperioderna i samma beteendeförsök och sedan över försöken om det fanns flera försök. För att kartlägga tidsfördelningen av optogenetiskt framkallade beteenden användes endast de fotostimuleringsperioder under vilka beteenden inträffade för att beräkna medelvärdet. I beteendeförsök med en hane, en ung råtta eller falska valpar användes som stimulus eller när ChR2-djur kastrerades, jämfördes optogenetiskt framkallade beteenden med spontana beteenden som inträffade under den 15 s-period som omedelbart föregick fotostimuleringsperioderna.
För att analysera effekten av optogenetisk hämning på ett specifikt beteende, poängsattes videorna först blint. Videologgar anpassades sedan till fotostimuleringsloggar för att extrahera beteendehändelser som mötte ljusstimulering. För att kartlägga olika parametrar för specifika beteenden, medelvärdesberäknades beteendehändelser som mötte ljusstimulering på försöksnivå om det fanns flera försök och sedan på djurnivå. För att plotta ackumulationsfördelningen av specifika beteenden analyserades endast beteendehändelser som mötte ljusstimulering.
För att simulera ett aktiveringscentrum för ett ChR2-djur beskars ett 1100×1500 μm stort område med en sida nära mittlinjen och den vinkelräta sidan nära hjärnans botten från varje koronalt hjärnsnitt och ändrades till 1 μm per pixel. c-Fos-signaler i varje 100×100 μm extraherades halvautomatiskt med hjälp av MATLAB-programmet tillsammans med ImageJ och summerades till en 11×15-matris i enlighet med deras placering inom varje sektion. Det genomsnittliga antalet NeuN/HuCD+-celler inom en kvadrat på 100 μm2 uppskattades till ~25. För att beräkna koordinaterna för aktiveringscentret längs den lateral-mediala och dorsal-ventrala axeln, medelvärdesberäknades antalen inom 11 × 15-matrisen över en serie hjärnsektioner som sträckte sig framåt och bakåt för varje djur och anpassades med en tvådimensionell gaussisk funktion i MATLAB. För att beräkna aktiveringscentrets anterior-posterior-koordinat summerades det totala c-Fos-antalet för varje hjärnsektion och anpassades med en enda Gaussisk funktion.
För fiberfotometriexperiment justerades råa fluorescenssignaler ytterligare i enlighet med den övergripande trenden för att ta hänsyn till fotoblekning. Försök med jitter, fyrkantiga signaler eller med extremt lågt signal-brusförhållande uteslöts från vidare analys. För det initiala svaret togs värdena för fluorescensförändringen (ΔF/F) fram genom att beräkna (F-F0)/F0, där F0 är medianen för baslinjefluorescenssignalen. För fluorescenssignaler som är anpassade till beteenden segmenterades data baserat på beteendehändelser inom enskilda försök och genomsnittliga signaler 10-15 s före beteendeinitiering användes som F0. För att analysera den statistiska betydelsen av de två händelserelaterade fluorescenssignalerna användes t-test med en false discovery rate (FDR) på 0,05. För att korrelera Ca2+-transienter och beteenden räknades en rampande Ca2+-händelse när ΔF/F-värdena var 3 standardavvikelser över baslinjen och varade längre än 2 s. Antalet Ca2+-händelser räknades mellan det första och sista beteendet och korrelerades med antalet beteendehändelser under den perioden. Endast beteendeförsök som hade mer än två monteringar och mer än en hämtning användes för korrelationsanalysen.
Histologiska bilder togs med ×20-objektiv i ett konfokalmikroskop om inget annat anges. Bilderna bearbetades och räknades i ImageJ med specialskrivna MATLAB-koder. All räkning gjordes av försöksledare som var blinda för djurets kön eller testtillstånd. För att analysera det virala uttrycket av ChR2 räknades sammärkningen av ChR2, c-Fos och Nissl i det centrala injektionsområdet manuellt. För att analysera sammärkningen av Esr1 och Vglut2, Vgat eller Galanin valdes fem relativt fasta områden i fem hjärnsektioner med liknande positioner ut för att räknas manuellt. För att testa specificiteten hos Cre-uttrycket i Esr1-cre-djur räknades sammärkningen av Esr1 och Cre manuellt i olika områden i flera snitt från ett djur. För att kvantifiera bilderna från catFISH-experiment, som togs med ett ×60-objektiv, identifierades celler som var positiva för cytoplasmatiskt eller nukleärt c-Fos och för Esr1 med DAPI som motfärgning och räknades manuellt. För att kvantifiera effekterna av viral ablation av Esr1+-neuroner räknades Esr1+-signaler i mPOA enligt definitionen i Allen Brain Atlas för båda sidor med hjälp av opartisk stereologi med programvaran Stereo Investigator (MBF bBioscience). Med hjälp av en optisk fraktioneringssond räknades Esr1+-signalerna i en 30×30 μm stor räknebox inom ett 100×100 μm stort provtagningsnät. För att kvantifiera effekterna av viral ablation av Vgat+ eller Vglut2+ neuroner avbildades hjärnsektioner med ×10 objektiv via Olympus VS120. Områden som färgades med Vgat+ eller Vglut2+ signaler inom mPOA och angränsande regioner extraherades halvautomatiskt med hjälp av MATLAB-koder.
Statistik
För stapeldiagram presenteras data som medelvärde ± s.e.m. I box- och whiskersdiagram presenteras data som min- till max-whiskers och medelvärdet indikeras med ”+” och medianen indikeras med en horisontell linje. Om inget annat anges utfördes följande statistiska tester och alla tester angavs som tvåsidiga. Kategoriska data analyserades med Fishers exakta test. Parade data analyserades med hjälp av parningstest. För att analysera den statistiska skillnaden i ackumulationsfördelningen användes Kolmogorov-Smirnov-testet med två stickprov. Data med en oberoende variabel analyserades med envägs ANOVAs följt av post hoc-test med Bonferroni-korrigering. Data med två oberoende variabler analyserades med tvåvägs ANOVAs följt av post hoc-test med Bonferroni-korrigering. För andra jämförelser testades data för fördelningen med Lilliefors normalitetstest. Om data klarade normalitetstestet användes ett parametriskt test (Student’s t-test). I annat fall användes icke-parametriskt Wilcoxon rangsummetest. P-värdet och korrelationskoefficienten för Pearsons korrelation beräknades med hjälp av en Student’s t-fördelning för en omvandling av korrelationen. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.
Datatillgänglighet
Alla data i den här studien är tillgängliga på begäran.