Mekanismer för resistens mot fluorokinoloner och karbapenemer i Pseudomonas putida

Abstract

Mål: Pseudomonas putida är en ovanlig opportunistisk patogen som vanligtvis är mottaglig för antimikrobiella medel. Uppgifter om resistens mot antimikrobiella medel i kliniska P. putida-isolat är begränsade.

Patienter och metoder: Mottaglighet för fluorokinoloner, karbapenemer och andra antibiotika karakteriserades hos fem kliniska isolat av P. putida som återfanns från olika patienter med urinvägsinfektioner som orsakande patogener. Fluorokinolon- och karbapenemresistens karakteriserades genetiskt med metoderna PCR och DNA-sekvensering. Profiler för yttre membranprotein (OMP) karakteriserades genom SDS-PAGE.

Resultat: Fyra av fem isolat var resistenta eller intermediära mot både fluorokinoloner och karbapenemer. Nukleotidsekvenser i de kinolonresistensbestämmande regionerna tydde på att aminosyramutationer som Thr-83→Ile i GyrA och Glu-469→Asp i GyrB kan bidra till hög resistens mot fluorokinoloner. Fyra metallo-β-laktamasproducerande isolat som visade resistens mot karbapenemer bar på metallo-β-laktamasgener av IMP-typ. En kombinerad effekt av minskad produktion av 46 kDa OMP och metallo-β-laktamasproduktion visades av ett P. putida-isolat som uppvisade de högsta MIC:erna för karbapenemer.

Slutsatser: Denna studie identifierade mekanismer för resistens mot fluorokinoloner och karbapenemer i kliniska P. putida-isolat.

Introduktion

Pseudomonas putida, en icke-fermenterande gramnegativ bacill, är en opportunistisk humanpatogen som ansvarar för bakteriemi och sepsis hos neonatala, neutropeniska och cancerpatienter samt urinvägsinfektioner (UTI).1-4 Även om det är ovanligt kan P. putida vara en orsak till nosokomiala infektioner hos komprometterade värdar.3

De flesta P. putida är känsliga för antimikrobiella medel som karbapenemer, fluorokinoloner och aminoglykosider.5-7 Kliniska isolat av P. putida som producerar metallo-β-laktamas som ger resistens mot β-laktamer, inklusive karbapenemer, har dock rapporterats.3,4,8,9 Vidare rapporterades nyligen metallo-β-laktamasproducerande isolat som visade resistens mot ciprofloxacin, gentamicin och tobramycin utöver β-laktamer.3 Uppkomsten av multiresistent P. putida har blivit en orsak till svårigheter vid behandling av infektioner och utgör en risk för nosokomial överföring.

I några få tidigare studier har antibiotikaresistens hos P. putida karakteriserats med avseende på produktion av metallo-β-laktamaser och egenskaper hos utflödessystem.3,4,8-12 Karbapenemresistenta P. putida producerar ofta metallo-β-lactamaser av IMP- och VIM-typ enligt rapporter från Europa, Korea och Japan.3,4,8,9,9,9a Effluxsystem som TtgABC, MepABC, TtgDEF och ArpABC kan också bidra till multipel läkemedelsresistens hos P. putida.10-12Pseudomonas aeruginosa har förmågan att snabbt bli resistent under behandlingsförloppet13 , men det är oklart om P. putida har samma potential. För att bedöma riskerna för att antibiotikaresistens ska uppstå krävs rikliga uppgifter om resistens mot antimikrobiella medel i kliniska P. putida-isolat. I denna studie fastställde vi känslighet för antimikrobiella medel, inklusive fluorokinoloner och karbapenemer, och karakteriserade resistensmekanismer mot fluorokinoloner och karbapenemer i kliniska P. putida-isolat som återfanns som patogener som orsakade urinvägsinfektioner under en ettårsperiod på vårt sjukhus.

Patienter och metoder

Patienter

Fem patienter (fyra män och en kvinna) som diagnostiserats med akuta, upprepade eller kroniska urinvägsinfektioner orsakade av P. putida vid Hamamatsu University Hospital ingick i vår studie från oktober 2001 till september 2002.

Bakteriestammar och mikrobiologiska metoder

Stammar som användes i denna studie var fem kliniska isolat av P. putida som återfanns från olika patienter som orsakande patogener. Identifiering utfördes med biokemiska standardtester i vårt kliniska mikrobiologiska laboratorium. Samtliga isolat erhölls från urin. De SpeI-begränsade fragmentmönstren i det kromosomala DNA:t hos dessa fem isolat varierade (figur 1). Bakterierna förvarades vid -70 °C i hjärtinfusionsbuljong (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) innehållande 20 % glycerol. Därefter inokulerades bakterierna på hjärtinfusionsagarplattor (Nissui Pharmaceutical) och inkuberades vid 37 °C över natten. MIC bestämdes genom en agarutspädningsmetod enligt beskrivning av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), tidigare National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).14 Känslighetstestning utfördes med Mueller-Hinton-agar (Nippon Becton Dickinson, Tokyo, Japan) i enlighet med tillverkarens anvisningar. MIC-tolkningskriterierna för ceftazidim, imipenem, meropenem, norfloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, gentamicin, amikacin och minocyklin följde CLSI/NCCLS:s kriterier.14 MIC-brytpunkterna för andra antimikrobiella medel definierades inte.

Antimikrobiella medel

Amplifiering och DNA-sekvensering av regioner som bestämmer kinolonresistens

Kromosomalt DNA extraherades från P. putida-isolat enligt tidigare beskrivning.15 PCR-amplifiering utfördes med specifika primerset. En primeruppsättning bestående av 5′-gacggcctgaagccggtgccac-3′ och 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplifierade ett 417 bp-fragment av de kinolonresistensbestämmande regionerna (QRDR) i gyrA-genen från positionerna 115 till 531.16 En primeruppsättning bestående av 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ och 5′-tacaggcgcgcgacaggcgctt-3′ amplifierade ett 739 bp stort fragment av QRDR:erna i gyrB-genen från positionerna 1073 till 1811.17 En primeruppsättning bestående av 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ och 5′-agcagcacctcctcggaatagcg-3′ amplifierade ett 262 bp-fragment av QRDRs i parC-genen från positionerna 158-419.18 Amplifikationer utfördes med Advantage-GC2-enzymet (BD Biosciences Clontech Japan, Tokyo, Japan) i enlighet med tillverkarens instruktioner. QRDR:erna sekvenserades med hjälp av ett BigDye terminator v3.0 Taq cycle sequencing ready reaction kit med AmpliTaq DNA-polymeras (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) och ett automatiserat DNA-sekvenseringssystem (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Genetisk detektion av metallo-β-laktamasgener

Preparering av yttre membranproteiner

Uttre membranproteiner (OMP) framställdes enligt tidigare beskrivning21. Proverna analyserades med SDS-PAGE.

Resultat

Känslighet

Resultaten av känslighetstestning för fluorokinoloner och karbapenemer sammanfattas i tabell 1 respektive 2. MIC för β-laktamer varierade från >128 mg/L för ampicillin och cefaloridin, 2 till >128 mg/L för ceftazidim, 1 till 128 mg/L för imipenem, 0,5 till >128 mg/L för panipenem, 4 till >128 mg/L för meropenem och 1 till >128 mg/L för biapenem. MIC-områdena för aminoglykosider och minocyklin var följande: De följande värden gäller: 0,25-8 mg/L för gentamicin, 0,5-8 mg/L för amikacin, 0,5-1 mg/L för kanamycin och 4-64 mg/L för minocyklin. Fyra isolat var resistenta eller intermediära mot både fluorokinoloner och karbapenemer, medan ett isolat, HU2001-429, var mottagligt för både β-laktamer och fluorokinoloner. Tre P. putida-isolat, HU2001-412, HU2001-419 och HU2001-451, uppvisade resistens mot alla undersökta β-laktamer, såsom ceftazidim, imipenem och meropenem. Tre isolat, HU2001-412, HU2001-419 och HU2002-467, uppvisade hög fluorokinolonresistens (>128 mg/L), inklusive norfloxacin, levofloxacin, sparfloxacin, gatifloxacin och pazufloxacin, och även minocyklinresistens (32 till 64 mg/L). I de fem isolaten var MIC-området för sitafloxacin mellan ≤0,125 och 8 mg/L.

Fluorokinolonresistens

Karbapenemresistens

Av fem P. putida-isolat bar fyra som uppvisade karbapenemresistens på metallo-β-laktamasgen av IMP-typ, medan metallo-β-laktamasgener av VIM-typ inte påvisades med PCR (tabell 2). MIC-områdena för karbapenemer hos P. putida med metallo-β-lactamasgener av IMP-typ var följande: 8 till 128 mg/L för imipenem, 32 till >128 mg/L för panipenem, 128 mg/L eller mer för meropenem och 32 till >128 mg/L för biapenem. I P. putida HU2001-451, som uppvisade de högsta MIC:erna för karbapenemer bland de fem isolaten, var produktionen av 46 kDa OMP odetekterbar genom SDS-PAGE, medan produktionen av P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 och HU2002-467 detekterades på liknande sätt (tabell 2).

Diskussion

I denna studie karakteriserade vi känslighet för fluorokinoloner och karbapenemer hos fem kliniska isolat av P. putida isolerade från olika patienter med akuta, upprepade eller kroniska urinvägsinfektioner. Alla fem isolaten uppvisade olika PFGE-genotyper, vilket tydde på att ingen av de infektioner som orsakades av dessa P. putida var nosokomiala. Fyra av fem isolat var resistenta eller intermediära mot både fluorokinoloner och karbapenemer. Tre isolat uppvisade hög resistens (>128 mg/L) mot alla undersökta fluorokinoloner utom sitafloxacin. Bland de fluorokinoloner som undersöktes i denna studie visade sitafloxacin överlägsen effekt mot P. putida-isolaten. Dessa isolat som var mycket resistenta mot fluorokinoloner var också resistenta mot karbapenemer och minocyklin. Alla isolat var mottagliga för aminoglykosider som amikacin.

Studier av fluorokinolonresistens hos P. putida är begränsade.6,12 Hos P. aeruginosa omfattar de viktigaste mekanismerna som är ansvariga för fluorokinolonresistens aminosyramutationer i DNA-gyrase eller topoisomeras IV som orsakas av mutationer i QRDR:erna hos GyrA och ParC, medan vissa rapporter har föreslagit att mutationer i GyrB är inblandade i fluorokinolonresistens.18,22 En sekundär resistensmekanism hos P. aeruginosa som involverar effluxsystem bidrar till minskad känslighet för fluorokinoloner.22,23 I den här studien jämfördes aminosyraförändringar i QRDRs för GyrA, GyrB och ParC mellan fem kliniska isolat av P. putida. Fluorokinolonresistenta P. putida hade ytterligare mutationer som Thr-83→Ile i GyrA och Glu-469→Asp i GyrB, som motsvarade mutationer som hittades i fluorokinolonresistenta P. aeruginosa.22,23 Dessa resultat tyder på att aminosyramutationer i QRDRs såsom Thr-83→Ile i GyrA och Glu-469→Asp i GyrB kan bidra till hög resistens mot fluorokinoloner, även om det inte fastställdes om transformation med plasmider som bär på gyrA-, gyrB- eller parC-gener av vildtyp i sådana isolat skulle sänka MIC för fluorokinoloner.24 MIC-området för sitafloxacin var mellan ≤0,125 och 8 mg/L för de fem P. putida-isolaten. Även om tidigare rapporter har visat att överuttryck av utflödessystemen TtgABC, MepABC, TtgDEF och ArpABC också kan bidra till multipel läkemedelsresistens hos P. putida,10,11,12 förblev utflödessystemens roll oklar i den här studien.

Carbapenemresistens hos P. putida som orsakas av produktion av metallo-β-laktamas har rapporterats.3,4,8,8,9,9a Dessa metallo-β-laktamaser som hittats i P. putida omfattade IMP- och VIM-typer. 3,4,8,9,9,9a I de fyra karbapenemresistenta P. putida påvisades produktion av metallo-β-laktamaser med hjälp av en skivdiffusionsmetod (data visas inte). Dessa isolat bar på metallo-β-laktamasgener av IMP-typ, medan metallo-β-laktamasgener av VIM-typ inte påvisades genom PCR. Prevalensen av metallo-β-laktamasproducerande P. putida är ett viktigt kliniskt problem och utgör en reservoar för genetiska bestämningsfaktorer för β-laktamresistens. I P. aeruginosa omfattar andra viktiga mekanismer för karbapenemresistens mutationsimpermeabilitet som uppstår genom förlust av OprD – en porinbildande transmembrankanal som är tillgänglig för karbapenemer men inte för andra β-laktamer – förutom produktion av metallo-β-laktamaser21,25,26 . Förlust av OprD resulterar i resistens mot imipenem och minskad känslighet för meropenem hos P. aeruginosa.27 I P. putida HU2001-451, som uppvisar de högsta MIC:erna (≥128 mg/L) av alla karbapenemer bland fyra karbapenemresistenta isolat, var produktionen av 46 kDa OMP minskad i jämförelse med de andra isolaten. OMP-profilerna hos P. putida HU2001-451 liknade dem hos karbapenemresistenta P. aeruginosa, där minskad produktion av OprD identifierades i vår tidigare studie.21 Dessa resultat visade en kombinerad effekt av minskad produktion av 46 kDa OMP som samvarierar med produktion av metallo-β-laktamas på karbapenemresistens hos isolatet, även om det var oklart om andra β-laktamaser hade betydelse för karbapenemresistensen.

Slutsatsen är att vi har karakteriserat fluorokinolon- och karbapenemresistens hos kliniska isolat av P. putida. Våra resultat tyder på att aminosyramutationer i QRDRs, såsom Thr-83→Ile i GyrA och Glu-469→Asp i GyrB, kan bidra till hög resistens mot fluorokinoloner hos P. putida. Fyra metallo-β-laktamasproducerande P. putida-isolat som visade resistens mot karbapenemer bar på genen för metallo-β-laktamas av IMP-typ. Vi fann en kombinerad effekt av minskad produktion av 46 kDa OMP och produktion av metallo-β-laktamas som ökade karbapenemresistensen hos ett isolat av P. putida som uppvisade de högsta MIC:erna för karbapenemer.

Vi tackar Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japan, för PFGE-analys. T. H. stöds av ett Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) från Japans ministerium för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik.