Molecular MedicineReports

Introduktion

Pesticider är ämnen eller blandningar av ämnen som används för att förebygga, förstöra, avvärja eller lindra skadedjur, däribland insekter, gnagare, ogräs och andra oönskade organismer (1,2). Den globala användningen av bekämpningsmedel, särskilt inom jordbruket, har därför ökat under de senaste åren på landsbygden. Den extensiva jordbruksproduktionen innebär en stor användning av bekämpningsmedel, vars rester förorenar luft, jord, vatten, växter, skördade produkter, utrustning, kläder samt vävnader från människor och djur. De bekämpningsmedel som används och som kommer in i människokroppen genom inandning, sväljning och hudabsorption kan orsaka förgiftning (2-4). Graden av genererad skada beror på ämnenas inneboende toxicitet samt på individens hälsostatus och känslighet (2,4-6).Exponering för bekämpningsmedel utgör en potentiell hälsorisk för befolkningen i allmänhet och för jordbruksarbetare i synnerhet (7-12).

Många studier har fokuserat på sambandet mellan exponering för bekämpningsmedel och förekomst av cancer, t.ex. sarkom, multipelt myelom, urinblåsecancer, cancer i bukspottkörteln och leukemi (13-21). Vissa forskare har observerat att yrkesmässig exponering för bekämpningsmedel har varit förknippad med risken för non-Hodgkins lymfom (NHL) (22-24).NHL är en heterogen grupp av lymfoproliferativa maligniteter som kan uppstå från B- eller T-lymfocyter. Ömsesidiga rearrangemang av B-cellars immunglobulin- eller T-cellreceptorgener förekommer med onkogener i omogna lymfoida celler i benmärgen eller mer mogna celler i perifera lymfoida organ (25,26).Dessa kromosomala translokationer resulterar ofta i överuttryck av onkogener och leder till att cellerna blir maligna och sprider sig på ett okontrollerat sätt (26).

Den kromosomala translokationen t(14;18)(q32;q21) är en av de vanligaste kromosomala avvikelserna vid NHL som förekommer i 70-90 % av fallen av follikulärt lymfom (FL), 20-30 % av diffust storcelligt B-celligt lymfom och 5-10 % av andra mindre vanliga subtyper (27). Dessutom har en ökad prevalens av den kromosomala translokationent(14;18)(q32;q21) upptäckts i perifera blodlymfocyter från personer som yrkesmässigt exponerats för bekämpningsmedel (28,29).

Syftet med den här studien är att upptäcka effekterna av bekämpningsmedel på den kromosomala translokationent(14;18) hos lantarbetare efter kortvarig exponering.

Material och metoder

Etiskt uttalande

Forskningsprotokollet godkändes av den etiska kommittén vid Catanias universitetssjukhus (Catania, Italien) och alla försökspersoners skriftliga informerade samtycke inhämtades innan de ingick i studien.

Studieutformning och exponering för bekämpningsmedel

Detta var en fall-kontrollstudie som genomfördes i provinsen Ragusa (Sicilien, Italien) med en befolkning på 320 000 personer. Det är ett distrikt med mycket jordbruk där en stor del av befolkningen är anställd på ~25 000 gårdar som producerar frukt och grönsaker i växthus och produkter från djuruppfödning. Alla dessa verksamheter innebär att stora mängder bekämpningsmedel används. De viktigaste grödorna är morötter, potatis och zucchini på friland och tomater, auberginer, paprika och zucchini i växthus (30).

Femtiotvå arbetstagare som yrkesmässigt exponerats för bekämpningsmedel och 52 icke-exponerade rekryterades. Exponerade arbetstagare som deltar i denna studie utför sitt arbete med skyddsutrustning: handskar, masker, overaller och skyddsglasögon. Bekämpningsmedlet applicerades 5-6 gånger i veckan under 6-7 arbetstimmar. Icke-exponerade arbetstagare (kontroll) hade ingen kontakt med bekämpningsmedel. Exponerade arbetstagare rekryterades på säsongsbasis (april till augusti) för odling av tomater i växthus.I tabell I redovisas de bekämpningsmedel som de exponerade arbetstagarna använde. Det var inte möjligt att påvisa exponeringsbiologiska markörer med avseende på använda bekämpningsmedel.

Tabell I. Bekämpningsmedel som används i växthus vid odling av tomater.

Ett strukturerat frågeformulär som undersökte miljö- och yrkesrisker administrerades av utbildade intervjuare för att samla in exakta uppgifter om demografi, sjukdomshistoria, hälsovårdsvanor och exponering för bekämpningsmedel och/eller andra kemikalier. Uteslutningskriterier var diabetes, högt blodtryck, sköldkörtel-, lever-, njur-, lung- och hematologiska sjukdomar.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2)-translokation

Perifera blodprover (10 ml/subjekt) samlades in i vacutainer EDTA (K2)-rör (BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, USA). DNA extraherades från de PBMC:er som ingick i den buffy coat enligt tillverkarens anvisningar.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2)-translokation, i major breakpoint region (MBR) och minor cluster region (mcr), bedömdes genom polymeraskedjereaktion (PCR) som tidigare rapporterats (31). AccuPrime™ SuperMix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) användes för att öka PCR-analysens specificitet och känslighet. Känsligheten för vår analys var 10-5.

DNA-integriteten hos varje prov kontrollerades genomamplifiering av ett 430 bp-fragment av tillväxthormon(GH)-genen genom PCR. De framåt- och bakåtriktade primersekvenser som användes för GH-amplifiering var följande: 5-CACCATTACATCCCACCT-3 respektive5-GCTTCTCTTGCTTGAGTGA-3. De PCR-förhållanden som användes för GH-amplifiering var identiska med dem som rapporterats för MBR(31).

PCR-produkterna separerades genom elektrofores på 2,5 % agarosgel. Positiva och negativa kontrollprover ingick i alla steg av de experimentella förfarandena.Enstaka band som erhållits genom amplifiering av MBR och MCR från blodprover renades från gelen och sekvenserades sedan på enABI 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) som tidigare rapporterats (31).

Statistisk analys

Data sammanfattades som medelvärde ± SD för kontinuerliga variabler och frekvenser för kategoriska variabler. Normaliteten kontrollerades med Kolmogrov-Smirnov-testet och varianshomogeniteten med Levenes-testet. Logistisk regression användes för att utvärdera förekomsten av translokation t(14;18) hos arbetstagare som exponerats för bekämpningsmedel, rökare och alkoholkonsumenter. Dataanalysen utfördes med hjälp av GraphPad Prism version 7.0 (GraphPad Software,Inc., La Jolla, CA, USA).

Resultat

Den exponerade gruppen uppvisade liknande egenskaper som den icke-exponerade. I synnerhet var alla försökspersoner män och det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader i fråga om ålder, BMI, rökvanor, alkoholintag, arbetsålder och exponering för solljus.

Lantbruksarbetare exponerades i genomsnitt för bekämpningsmedel ~3,7 timmar per dag under 5 år. I tabell II redovisas de viktigaste egenskaperna hos urvalet; figur 1.

Tabell II. Karaktäristika hos studiepopulationen uttryckta som frekvens eller medelvärde ± SD.

Frekvensen av BCL2-IGH t(14;18)-translokation hos arbetare som yrkesmässigt exponerats för bekämpningsmedel var 10 % (5 av 52) jämfört med 8 %.% (4 av 52) i kontrollgruppen. Dessa resultat visade inget signifikant samband mellan yrkesmässig exponering för bekämpningsmedel och en ökad frekvens av den kromosomala translokationenBCL2-IGH t(14;18) hos jordbrukare (tabell III).

Tabell III. Logistisk regression t(14;18)kromosomtranslokation.

Det var dessutom inte möjligt att bedöma frekvensen av t(14;18) i förhållande till de typer av bekämpningsmedel som använts,eftersom alla försökspersoner exponerades för insekticider och fungicider.

Diskussion

Den kromosomala translokationen t(14;18)(q32;q21) är en av de vanligaste kromosomala abnormaliteterna vid NHL. Denna translokation involverar två specifika loci, lokus IgH (immunoglobulin heavychain) på kromosom 14q32 och lokus B-cellleukemi/lymfom 2 (BCL2) på kromosom 18q2l (32).

Under den typiska translokationsprocessen placeras BCL2-genen på kromosom 18 bredvid den transkriptionellt aktiva IgH-genen på kromosom 14, vilket resulterar i överuttryck av den förstnämnda genen. Följaktligen ökar BCL2:s ökade antiapoptotiska funktion cellöverlevnaden, vilket utgör ett tidigt steg i den maligna processen för NHL (32-34).

En ökad förekomst av NHL har rapporterats bland jordbrukare och andra yrkesgrupper som arbetar med bekämpningsmedel (35). Dessutom har en ökad förekomst av den kromosomala translokationen t(14;18)(q32;q21) påvisats i perifera blodlymfocyter från personer som yrkesmässigt exponerats för bekämpningsmedel (29,36,37).

I en nyligen genomförd studie på 96 lantarbetare fann Qaqish et al (1) att yrkesmässig exponering för bekämpningsmedel vid odling på öppet fält och insekticider som används på djur ökade frekvensen av den kromosomala translokationen t(14;18). Lantbrukare som yrkesmässigt exponerades för bekämpningsmedel och insekticider hade 13,5 gånger större sannolikhet att ha t(14;18). I stället bar 63,5 % (61 av 96) av jordbrukarna jämfört med 11,5 % (11 av 96) av kontrollanterna på translokationen.

I vår studie var frekvensen av BCL2-IGH t(14;18)-translokationen hos arbetare som yrkesmässigt exponerats för bekämpningsmedel 10 % (5 av 52) jämfört med 10 % (5 av 52) av kontrollanterna. 8% (4 av 52) i kontrollgruppen, utan signifikanta statistiska skillnader.

Den skillnad i resultat mellan vår och Qaqishet al (1) kan tillskrivas den kortare exponeringstiden (50%) jämfört med den senare (10,9±7,9 vs 5,1±0,8 år).

I vårt urval använde sig dessutom alla arbetstagare av standardiserade SPD, medan det i Qaqish et al (1) endast var 2,1 % av lantbrukarna som använde masker och 27,1 % som använde masker och handskar.

Som Qaqish et al (1) visade kan användning av SPD bidra till att förebygga t(14;18).Risken för t(14;18) var signifikant förknippad med exponering för olika typer av bekämpningsmedel: insekticider, herbicider och fumiganter (28).

Chiu et al (28) observerade att användningen av insekticider och herbicider var förknippad med en 2,6- till 3-faldigt högre risk för oft(14;18)-positiv NHL. Dessa resultat stämmer överens med resultaten från tidigare studier där bekämpningsmedel var specifikt förknippade med follikulär NHL (23,38-40), som vanligtvis är positiv för t(14;18).

Chiu et al (28) och Schroeder et al (41) fann att risken för NHL i samband med jordbruk och exponering för dieldrin, lindan, atrazin eller fungicider var förknippad med t(14;18).

I Italien förbjöds användningen av bekämpningsmedel som dieldrin, lindan och atrazin för länge sedan. Dessutom utsattes de exponerade personerna i vår studie både för fungicider (propamokarbhydrochlorid, metalaxyl-M, cyprokonazol) och insekticider (tiametoxam, deltamatrin, akrinatrin och abamektin), vilket gör att det inte går att särskilja effekten av var och en av dem.

Resultaten av vår studie är i linje med de som observerats av andra (1,28), som upptäckte en ökad risk när insekticider och herbicider används under en längre tid och i samband med användning av SPD.

Vi utvärderade effekterna av potentiella förväxlingsfaktorer på frekvensen av upptäckt av BCL2-IGH t(14;18)-translokation. För det första bidrog inte alkoholkonsumtion till upptäcktsfrekvensen, eventuellt på grund av den låga alkoholkonsumtionen i vår undersökningsgrupp (17,6±8,5 vs. 18,7±7,7 g/dag för exponerade och icke-exponerade, respektive). Dessutom upptäckte vi inte något samband mellan provernas ålder och frekvensen av upptäckt av BCL2-IGH t(14;18) translokation (1,29).

Vår studie liksom Roulland et al (29) och Qaqish et al (1) inkluderade försökspersoner med en medianålder på <50 år, där ett samband med åldern endast upptäcktes i prover som var äldre än 60 (42) och 70 år (43). Dessutom ökade cigarettrökning inte frekvensen av BCL2-IGHt(14;18)-translokation i vårt prov, vilket stämmer överens med en tidigare studie (28). Vidare visade inte heller exponering för solljus någon effekt på t(14:18)-upptäcktsfrekvensen, vilket överensstämmer med andra studier (29).

Därmed kan man utifrån resultaten av vår studie dra slutsatsen att konstant användning av lagstadgade SPD och exponeringstid kan påverka translokationsfrekvensen hos arbetare som exponerats för bekämpningsmedel.

Vår studie skall fortsätta med en uppföljning av dessa arbetstagare för att bättre kunna fastställa vilken roll faktorn ”exponeringstid” spelar för genöverföringen.