Både denaturerad och nativ BR kan binda till GroEL
Centralt för mekanismen för GroEL-aktivitet är dess förmåga att känna igen ett brett spektrum av polypeptider, huvudsakligen genom interaktioner mellan de hydrofoba resterna i substratet och spiralerna H och I på GroEL:s apikala domäner (fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Här undersöktes först bindningen av både denaturerad och nativ BR till GroEL genom isotermisk titreringskalorimetri (ITC), eftersom varje tillstånd har rikligt med hydrofoba ytrester som är lättillgängliga för GroEL. Som visas i figur 2A ger titrering av GroEL med BR exoterma titreringstermogram i båda fallen. Värmeförändringarna beror specifikt på BR:s bindning till GroEL eftersom konsekutiv injektion av BR i analysbuffertarna utan chaperonin ger platta termogram (kompletterande fig. S1). Värmen för varje injektion som visas i fig. 2A integrerades, korrigerades med utspädningsvärmen och plottades mot molförhållandet BR: GroEL (fig. 2B). Värmeförändringen passar en uppsättning platser bindningsmodell (röda och blå kurvor), vilket ger en dissociationskonstant (Kd) nära 0,3 nmol/L för denaturerad BR respektive nära 6,0 nmol/L för nativ BR (tabell 1). Denatureringen av BR ökade således GroEL:s bindningsaffinitet för detta membranprotein med en storleksordning. Å andra sidan drivs bindningen av båda BR-proverna av en gynnsam entalpiändring (ΔH) och motverkas av en negativ entropiändring (ΔS); den bindningsstojometri (N) som bestämts i båda fallen är nära en enhet (tabell 1). Bindningen av den nativa BR är dock klart mindre enthalpisk med mindre entropikompensation.
BR-bindning till GroEL bedömd med ITC. A Titrering av GroEL med SDS-denaturerad BR (dBR, röd) eller nativ BR (nBR. blå). Termogrammen registrerades vid 20 °C med ett MicroCal ITC200-instrument. B Värmeutbyte för varje injektion i A integrerades och plottades mot molförhållandet BR:GroEL. Heldragna linjer representerar anpassningen av data till en modell med en enda uppsättning platser (alla platser är identiska och likvärdiga) och de erhållna termodynamiska parametrarna anges i tabell 1
Den lidformade co-chaperonin GroES är en viktig komponent i GroEL-medierad proteinveckning i bakterier, och har visat sig dela samma bindningsställen på GroEL med substratet (Chen och Sigler 1999). Titrering av GroEL med denaturerad BR i närvaro av GroES visar att GroES har liten effekt på BR-bindningen (kompletterande figur S2 och tabell 1). Detta resultat kan förstås om man tar hänsyn till Kd, som för bildandet av ett GroEL/ES-komplex tidigare bestämdes till 3 μmol/L och är betydligt högre än den för BR-GroEL-komplexet som bestämts här (Behlke et al. 1997). Detta tyder på en mycket svagare interaktion mellan de två chaperoninproteinerna och stämmer därmed överens med den obetydliga effekten. I närvaro av ATP, som reglerar bindnings- och frisättningscyklerna för GroEL och GroES in vivo, skulle dock affiniteten för GroEL/ES öka med tre storleksordningar (normalt Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), vilket teoretiskt sett skulle kunna konkurrera med BR-bindning till GroEL. Effekten av apoGroEL på BR-veckning och sedan GroES och ATP:s roll i denna process undersöktes därefter.
GroEL-GroES-systemet kan modulera BR-fällningen i närvaro av DDM
En del av SDS-denaturerad BR observerades återfälla sig när den späddes ut med ett överskott av det lösliggörande detergentet n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), vilket avslöjades genom att mäta återhämtningen av retinaabsorptionen (supplementär fig. S3) (Booth 1997). Ingen signifikant återhämtning kunde påvisas i analysbufferten utan detergent eller kompletterad med enbart GroEL. I närvaro av DDM visade dock tillsatsen av GroEL en tydlig effekt på BR-föjningen (kompletterande fig. S3). Hastighetskonstanten för GroEL (0,15 μmol/L)-medierad veckning, som bedömdes genom anpassning med enkel exponentiell kinetik, uppskattades vara ~ två gånger lägre än den spontana veckningen. GroEL är känt för att vanligtvis fördröja vikningen av lösliga proteiner som kan vikas effektivt i dess frånvaro. Detta har förklarats genom en konkurrens mellan intramolekylär veckning och intermolekylär bindning till GroEL (Gray och Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Det verkar helt rimligt att GroEL beter sig på liknande sätt vid återvikning av denaturerad BR. När koncentrationen av GroEL ökades till 0,30 μmol/L förändrades den uppskattade hastighetskonstanten inte uppenbart, medan vikningsutbytet nådde en mycket högre nivå än den spontana vikningen efter 60 minuter (kompletterande fig. S3). Dessa data visar att apoGroEL kan minska BR-foldningshastigheten men öka utbytet av det veckade proteinet.
Eftersom bakterieceller innehåller flera millimolars ATP och under normala förhållanden är det relativa molförhållandet mellan GroES och GroEL 1,9 och efter värmeschock 4,7 (Moparthi et al. 2013); GroEL kommer sannolikt inte att stanna länge utan att binda ATP och GroES. I närvaro av ATP (blått i fig. 3A) var återhämtningen av korrekt veckad BR betydligt snabbare och större jämfört med den med enbart apoGroEL eller den spontana processen (rött och svart i fig. 3A). Däremot visade kombinationen av GroEL och GroES liten effekt på hastigheten för den spontana veckningen men minskade utbytet i viss utsträckning (fig. 3A, cyan). Detta tyder på en interaktion mellan GroEL och GroES utan krav på ATP, troligen inducerad av BR bunden till GroEL, vilket i sin tur hade en negativ effekt på återvinningen av korrekt veckat protein. När det fullständiga chaperoninsystemet användes (fig. 3A, grönt) observerades maximal hastighetsökning men vikningsutbytet föll mellan de två föregående fallen.
Tidsförloppet för BR-faltning som moduleras av ATP-beroende GroEL-GroES-system. A Återhämtningen av viktad BR övervakades kontinuerligt med absorbans vid 554 nm. Följande tillsatser gjordes: ingen (svart); 0,3 μmol/L GroEL (röd); 0,3 μmol/L GroEL och 5 mmol/L ATP (blå); 0,3 μmol/L GroEL och 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES och 5 mmol/L ATP (grön). B Net GroEL-medierad BR-veckning utfördes först; sedan vid T = 60 min kompletterades provet med endast ATP, med endast GroES eller med båda enligt uppgift. C För att jämföra med A analyserades också effekten av den icke-cykliska versionen av GroEL med en enda ring (SR1) på BR-veckning. Koncentrationerna av SR1, GroES och ATP som användes var 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L respektive 5 mmol/L. D Effekterna av GroEL/ES plus ATP på BR:s naturliga veckning undersöktes genom att följa absorbansförändringen vid 560 nm. De koncentrationer av chaperonin och nukleotid som användes i B och D var desamma som i A. BR hölls på 2,4 μmol/L i alla experiment. De blå och gröna linjerna i A och den blå linjen i C representerar anpassningen av data till en trefas exponentiell ekvation, medan de övriga linjerna är anpassningen med en enkel exponentiell ekvation. Alla linjer i B och D är enkla guider för ögonen
Ovanstående resultat tyder på att ATP och GroES kan påverka den GroEL-medierade BR-föjningen på olika sätt. GroES-bindning till GroEL är något skadlig för vikningen, i motsats till den välkända positiva rollen av substratinkapsling i GroEL/ES-buren för den assisterade vikningen (Jewett och Shea 2010). Därefter ifrågasatte vi hur denna negativa effekt uppstod. Intressant nog underlättade enbart GroES eller dess mobila loopsekvens genom vilken GroES binder till GroEL också återhämtningen av vikta BR (kompletterande figur S4). Dessutom visade loopsekvensen en liknande effekt som GroES i den GroEL-medierade vikningen i frånvaro och närvaro av ATP (kompletterande figur S4). Även om den inte kan bilda ett förseglat lock över GroEL:s centrala kavitet som GroES, vilket innebär ett betydande bidrag från loop-GroEL-interaktionen till vikningen. Noterbart är att de hydrofoba rester vid GroEL:s apikala yta som är involverade i bindningen av GroES rörliga slinga mestadels överlappar med dem som är involverade i bindningen av substratproteinet (Motojima et al. 2000). Det är osannolikt att den hydrofoba BR försköts och frigjordes in i den hydrofila GroEL/ES-buren av den mobila slingan, särskilt med tanke på närvaron av DDM-miceller utanför buren, vilket ytterligare skulle gynna vikningen eller solubiliseringen av BR. Företrädesvis, vilket visats för den assisterade veckningen av flera lösliga proteiner (Motojima och Yoshida 2010), kan BR fångas in nära GroEL/ES-gränssnittet och delvis sticka ut till utsidan när hela systemet eller till och med enbart GroEL/ES användes i den här studien. En sådan interaktion kan hindra BR från att få tillgång till de gynnsamma DDM-mikellerna, vilket resulterar i det minskade vikningsutbytet som observerats med både GroES och dess mobila slinga.
Vissa studier tyder dock på att ATP:s och GroES:s roll endast är att dissociera klibbiga substrat (dvs. med en Kd i nmol/L-regionen som bestämts här), vilket begränsar den assisterade vikningshastigheten eller till och med hämmar GroEL:s vikningsaktivitet om den inte avlägsnas (Priya et al. 2013). För att testa om GroES och ATP visar en liknande effekt vid assisterad BR-fällning, inkuberade vi först apoGroEL med denaturerad BR i 60 minuter; därefter tillsatte vi GroEL eller/och ATP (fig. 3B). Den efterföljande tillsatsen av någon av komponenterna främjade BR-fällningen ytterligare, men var mindre effektiv än den samtidiga tillsatsen av båda, vilket visar på synergism mellan de två när det gäller att hjälpa den GroEL-medierade fällningen. Anisotropimätningar med BR-transmembranpeptider, som användes som mimetika för denaturerad BR för att kringgå de komplikationer som infördes av den dynamiska karaktären hos denaturerad BR och GroEL-BR-interaktionerna, visade att endast kombinationen av ATP och GroES kunde effektivt separera det förformade peptid-GroEL-komplexet (kompletterande fig. S5). Det verkar alltså som om både GroES och ATP är nödvändiga för att dissociera BR-konformare med hög affinitet och återskapa de avstannade GroEL-bindningsställena (eller katalytiska ställena).
För att ytterligare undersöka effekten av GroES och ATP på den GroEL-medierade BR-föjningen använde vi en GroEL-mutant med en enda ring (SR1) som bildar ett stabilt komplex med GroES (Weissman et al. 1995), i motsats till det cyklande GroEL-GroES-systemet. I likhet med vår observation med GroEL ökade ATP hastigheten och utbytet av SR1-medierad veckning (blått i fig. 3C), medan närvaron av GroES minskade båda aspekterna avsevärt (cyan) jämfört med fallet med enbart apoSR1 eller den spontana processen (rött eller svart). Eftersom denaturerad BR bestämdes med ITC att binda till SR1 med en stökiometri nära enhet (kompletterande fig. S2), och SR1 som användes var dubbelt så hög som koncentrationen av GroEL, spekulerar vi att fler BR-SR1-komplex bildades än BR-GroEL, varvid GroES utövade ett större inflytande på veckningen (cyan). Som förväntat visade tillsats av både ATP och GroES en obetydlig effekt på BR-återhämtning (grönt), vilket kan tillskrivas den irreversibla bindningen av GroES till SR1 i närvaro av ATP (Weissman et al. 1995). Dessutom tyder detta resultat på att den maximala hastighetsförstärkning som observeras med GroEL beror på ATP-reglerade multipla cykler av bindning och frisättning av GroES.
GroEL ensam eller i kombination med ATP eller/och GroES visade försumbar påverkan på strukturen hos nativ BR som solubiliserats med DDM (Fig. 3D), vilket pekar på en starkare intramolekylär interaktion inom det nativa proteinet än intermolekylär bindning till GroEL. Således är den chaperoninmedierade övergången av BR från det metastabila denaturerade tillståndet till det nativa tillståndet termodynamiskt gynnsam.
Evidens för både den chaperoninmedierade disaggregeringen och utvikningen
Mätning av den spontana BR-veckningen vid varierande koncentrationer visar att aggregering endast resulterade i en partiell återhämtning av korrekt veckad BR och att den skenbara hastigheten var koncentrationsoberoende, vilket innebär att aggregeringen var irreversibel (kompletterande fig. S6). I avsaknad av det lösliggörande tvättmedlet DDM uppskattades SDS-denaturerad BR med hjälp av fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) ha en diffusionskoefficient (~67 μm2/s) som är mycket lägre än den som är bunden till GroEL (~104 μm2/s) (fig. 4). Detta återspeglar att de aggregat som bildas av den denaturerade BR är ännu större än BR-GroEL-komplexet med en bindningsstoikiometri nära enheten enligt ITC. Detta innebär också att GroEL kunde störa aggregationsstrukturen och i huvudsak pumpa den produktiva veckningsvägen med monomerisk BR. Dessutom fastställdes att den nBR som solubiliserats med DDM hade en diffusionskoefficient på ~117 μm2/s, vilket är större än den för dBR med GroEL och mycket större än den för enbart dBR (fig. 4). Detta tyder på att nBR var väl dispergerad i närvaro av DDM och stöder också idén om GroEL-medierad disaggregering av dBR. När hela chaperoninsystemet tillsattes i denaturerad BR syntes dessutom omedelbart vita flockulenta utfällningar (data ej visad), vilket tyder på forcerad utvikning samt synergism mellan GroES och ATP i denna aspekt. Utan lösliggörande detergenter eller lipider som efterliknar biologiska membran i bulklösningen skulle ofveckad BR omedelbart aggregera och fällas ut, i motsats till den betydande ökning av veckningshastigheten som observerades i närvaro av DDM.
FCS-mätning av denaturerad BR i avsaknad eller närvaro av GroEL jämfört med nativ BR. Fluorescensautokorrelationsamplituder G(τ) för Alexa Fluor 488-fluorescens visades för SDS-denaturerad BR ensam eller med ett överskott av GroEL i avsaknad av lösliggörande detergent eller nativ BR lösliggjord med DDM. Diffusionskoefficienter (D) erhölls genom att anpassa autokorrelationskurvan med Eq. 1. Standardavvikelserna var från tre oberoende mätningar
Membraninsättning av BR medierad av GroEL-GroES
För att avgöra om eller hur GroEL-GroES skulle stödja integrering av BR i bilagret framställdes inverterade cytoplasmiska membranvesiklar (IMVs) från Escherichia. coli-celler och blandades med denaturerad BR i närvaro och frånvaro av apoGroEL eller plus ATP/GroES (fig. 5A). ApoGroEL orsakade en obetydlig förändring i återhämtningen av korrekt veckad BR i IMVs, vilket mättes med UV-Vis-spektroskopi (svart och rött). Till skillnad från återvikningen i DDM-mikeller visade sig tillsats av GroEL och ATP vara till nackdel för membraninsättningen (blått), medan GroEL i kombination med GroES underlättade denna process (cyan). Den verkliga orsaken till denna reproducerbara skillnad är inte känd, men IMV:s styvhet och den strukturella förändringen av GroEL-bunden BR som induceras av ATP- eller GroES-bindning kan vara möjliga orsaker. Det är känt att ATP-bindning av GroEL orsakar en utvidgning av öppningen till chaperoninets hålighet (Skjaerven et al. 2015). Denna förändring är mer märkbar än den som orsakas av enbart GroES-bindning till GroEL (Kim et al. 2005), vilket möjligen möjliggör utvikning av det bundna substratet (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), vilket är gynnsamt för produktiv vikning i ett lämpligt lösningsmedel. Till skillnad från DDM-micellerna, som är mycket dynamiska, kunde IMVs förmodligen inte snabbt skydda den utvikta BR-arten och tillhandahålla en fördelaktig mikromiljö för veckning i rätt tid. I jämförelse kan den svaga associeringen mellan GroES och GroEL i avsaknad av ATP leverera BR till de förberedda IMV:erna på ett mer effektivt sätt. I likhet med återvikningen i DDM-micellerna förbättrade dock det kompletta GroEL-GroES-systemet kraftigt membraninförandet av BR (grönt), som snabbt nådde ett stabilt tillstånd med en mängd återvunnen BR som låg mellan de två föregående fallen.
Införandet av BR i IMV:er medierat av GroEL-GroES-systemet. A Införandet och/eller omvikningen av denaturerad BR (2,4 μmol/L) i IMVs övervakades kontinuerligt med absorbans vid 554 nm. Följande tillsatser gjordes: ingen (svart); 0,3 μmol/L GroEL (röd); 0,3 μmol/L GroEL och 5 mmol/L ATP (blå); 0,3 μmol/L GroEL och 0,6 μmol/L GroES (cyan); 0,3 μmol/L GroEL, 0,6 μmol/L GroES och 5 mmol/L ATP (grön). B Native BR kan effektivt överföras till IMV i närvaro av GroEL med hjälp av ATP och GroES. De testade koncentrationerna av nativ BR, GroEL, GroES och ATP var 0,4, 5, 10 μmol/L respektive 5 mmol/L
Nästan användes fluorescensanisotropi för att undersöka effekterna av de bakteriella chaperoninerna på införandet av BR i IMV:er (fig. 5B). När fluorescensmärkt nativ BR blandades med en överdriven mängd GroEL försköts anisotropin till ett högre värde, vilket visar att membranproteinet bildade ett stabilt komplex med chaperoninet. Viktigt är att den efterföljande tillsatsen av IMV ledde till en ytterligare ökning av anisotropin, vilket tyder på att BR integreras i IMV. ATP och GroES visade sig ytterligare öka överföringen av BR till membranen, vilket också framgår av ökningen av anisotropin. Dessa resultat ger upphov till möjligheten att GroEL, tillsammans med GroES och ATP, kan ha en direkt roll i integreringen av proteiner i lipiddubbelskiktet in vivo.