Det är känt att HRP2-antigenet kvarstår i cirkulationen efter kurativ behandling och detta har lett till förslaget att HRP2-detekterande RDT:er har minskad specificitet när det gäller att detektera aktiv malariainfektion i områden med måttlig till hög smittspridning. Å andra sidan metaboliseras pLDH snabbare och därför förväntas RDT:er som detekterar detta enzym bli negativa snabbare efter malariabehandling. En frestande strategi för att skilja tidigare behandlade infektioner från pågående infektioner är därför att använda kombinerade HRP2- och pan-detekterande RDT:er eller RDT:er som innehåller separata HRP2- och Pf-pLDH-testband. Även om detta tillvägagångssätt till en början låter rimligt under omständigheter där en nyligen inträffad infektion har inträffat, är dess allmänna tillämpning på den kliniska hanteringen av feberfall föremål för diskussion. Hawkes et al. drar slutsatsen att krav på positivitet för både HRP2- och pLDH-banden i en kombinerad RDT kan förbättra den diagnostiska specificiteten för falciparummalaria i Afrika söder om Sahara, genom att man utesluter falskt positiva HRP2-resultat på grund av ihållande antigenaemi. Denna slutsats drogs efter en jämförelse mellan RDT-resultat och mikroskopi i ett urval av barn under fem år som lagts in på sjukhus för febril sjukdom. Även om detta förslag kan vara lämpligt för urval av individer för kliniska prövningar, är det tveksamt om detta kan utvidgas till klinisk diagnos eller hantering, eftersom denna slutsats bygger på antagandet att alla RDT-test som är HRP2-positiva men pLDH-negativa representerar persisterande antigenaemi. Detta antagande bygger på förutsättningen att alla pågående infektioner ger positiva resultat på både HRP2- och pLDH-banden i RDT:erna, ett påstående som inte har testats tidigare på ett systematiskt sätt för flera RDT-produkter.
För att åtgärda denna lucka har man i denna studie analyserat data som genererats under WHO-FIND:s produkttestprogram för RDT:er för malaria med särskilt fokus på reaktiviteten hos enskilda testband i 18 kombinerade RDT:er för malaria som uppfyller WHO:s nuvarande rekommenderade upphandlingskriterier. Sjutton av dessa produkter använde PfHPR2 för detektion av P. falciparum. Under WHO-FIND-produkttesterna kunde dessa 18 produkter konsekvent detektera >75 % av proverna av vildtyp P. falciparum och P. vivax vid en utspädning på 200 parasiter/μL med låg andel falskt positiva resultat eller felaktig artidentifiering. Även om denna studie fokuserade på detektion av P. falciparum, begränsades de RDT:er som valdes ut för att ingå i denna analys avsiktligt till dem som uppfyllde kriterierna för både P. falciparum- och P. vivax-detektion för att man skulle vara säker på att pan-testbanden fungerade bra när de tolkades enligt tillverkarens anvisningar. Detta undanröjer möjligheten att de resultat som observerades i denna studie orsakades av ett dysfunktionellt panband.
Resultaten av den aktuella analysen tyder på att det finns en skillnad i känsligheten hos de HRP2-detekterande testbanden och pan-pLDH-testbanden när det gäller upptäckt av aktiv infektion. Vid låga parasittätheter observerades att det HRP2-detekterande bandet gav ett positivt resultat i avsaknad av ett positivt pan-band i över 40 % av de positiva testerna, och denna procentsats var produktspecifik. Denna trend var mindre tydlig vid högre parasittätheter där båda banden tenderade att vara positiva samtidigt. Detta resultat stämmer överens med det som tidigare rapporterats för produkten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (katalognummer 05FK60, Standard Diagnostics Inc., Sydkorea) där andelen positiva tester på både HPRP2- och pLDH-banden successivt ökade med parasittätheten från 6,7 % vid <100 parasiter/μL till 98,5 % vid >1000 parasiter/μL . Liknande mönster rapporterades också för produkten SD Malaria Antigen P.f (katalognummer 05FK90, Standard Diagnostics Inc. Sydkorea) .
Analysen visade också att även när både pan- och P. falciparum-banden var positiva var bandintensiteten för pan-bandet generellt sett lägre än Pf-bandet, oavsett parasittäthet. Vid den lägre parasittätheten på 200 parasiter/μL hade 65 % av de positiva pan-banden en intensitet på 1. Denna andel minskade till 16 % när proverna innehöll 2 000 eller 5 000 parasiter/μL. Även när panbandet är positivt är det alltså ofta svagt. De RDT-tester som utförs för WHO:s produkttestprogram FIND sker vid CDC under idealiska förhållanden, vilket underlättar identifieringen av dessa svagt positiva resultat. Svaga band är dock ofta svåra att se och kan mycket väl missas av hälso- och sjukvårdspersonal som arbetar under sämre ljusförhållanden eller med nedsatt synskärpa . Detta skulle öka andelen RDT:er som har ett positivt HRP2-band och ett negativt panband.
Det finns flera möjliga orsaker till de observerade skillnaderna i positivitet och intensitet hos HRP2 Pf-banden jämfört med pLDH-panbanden. För det första kan den relativa förekomsten av HRP2 och pLDH skilja sig åt inom parasiter. De prover som användes i den aktuella studien hade breda men liknande koncentrationsintervall för HRP2 och pLDH och det fanns en signifikant positiv korrelation mellan de två antigenkoncentrationerna. Det verkar därför inte som om stora skillnader i antigenkoncentrationen var orsaken till skillnaderna i testbandets prestanda mot P. falciparum.
Den andra möjliga orsaken är relaterad till skillnader i antigenets aviditet för att binda de antikroppar som är bundna till RDT-testbanden. De nuvarande resultaten visar att det krävs cirka 4 ng/ml HRP2 för att få ett positivt HRP2-band i över 95 % av testerna, jämfört med över 45 ng/ml för pan-pLDH. Denna koncentrationsskillnad är förenlig med att HRP2-antigenet har flera bindande epitoper på grund av sin upprepade struktur, jämfört med pLDH, som har en enda epitop. Lee et al. rapporterade att de vanligaste HPR2-motiven förekom inom HRP2-sekvensen med en frekvens på 8-25, beroende på motivet och den specifika sekvensen. Denna frekvens överensstämmer ungefär med de skillnader i tröskelkoncentration som observerats här. Det verkar alltså som om skillnaden i antikroppsbindande aviditet mellan HRP2 och pLDH kan vara en orsak till skillnaderna i känslighet för respektive testband. Det är osannolikt att bandens ordningsföljd på remsan är orsaken till pan-testbandens försämrade prestanda, eftersom pan-testbandet för alla utom två tester som ingår i denna analys ligger längst bort från ursprunget, och denna position är fördelaktig eftersom flödeshastigheten med vilken analyten passerar linjen för fångstreagenset är långsammare, och den effektiva koncentrationen av analyten i provet är högre .
Flera studier har utförts för att utvärdera prestandan hos specifika RDT:er för malaria i olika miljöer. Få har dock direkt jämfört HRP2-detekterande RDT:er med pLDH-detekterande RDT:er och undersökt potentiella orsaker till skillnaderna mellan de två typerna av tester. En longitudinell studie i Uganda visade att HRP2-detekterande RDT:er ger bättre detektion av parasiter vid låga tätheter jämfört med pLDH-detekterande RDT:er, men att de har lägre specificitet på grund av att HRP2-antigenaemia långsammare försvinner från blodcirkulationen . Skillnader har också observerats i prestanda mellan regioner med olika överföringsintensitet, och denna skillnad tillskrivs den överlägsna förmågan hos HRP2-detekterande RDT:er jämfört med pLDH-detekterande RDT:er att detektera subpatent parasitemi . Även om dessa resultat har erhållits genom att jämföra olika RDT:er som båda påvisar P. falciparum, förefaller de relevanta för kombinationstester med antikroppar mot dessa två antigener. Det skulle vara möjligt att skilja mellan ihållande HRP2-antigenemi och livskraftig falciparumparasitemi i ett givet blodprov genom att jämföra resultaten av en HRP2-baserad RDT med en separat, lika välfungerande RDT som innehåller ett falciparum-pLDH-band, men detta är inte ett genomförbart förslag för fältanvändning.
Därmed kvarstår problemet med hur man kliniskt skall hantera en febril patient som nyligen behandlats mot malaria och som returnerar ett positivt HRP2-band, men ett negativt pLDH-band på en kombinerad RDT. Detta kan bero på ihållande antigenaemi eller återinfektion med malaria eller rekrudescens (behandlingssvikt). Behandlingssvikt kan bero på läkemedelsresistens eller otillräcklig exponering för läkemedlet på grund av suboptimal dosering, dålig följsamhet, kräkningar, ovanlig farmakokinetik hos en person eller undermåliga läkemedel. Det är viktigt att utifrån patientens anamnes avgöra om han eller hon kräktes vid föregående behandling eller inte fullföljde hela behandlingen. Dessa fall måste behandlas på nytt med den artemisininkombinationsbehandling (ACT) som rekommenderas som förstahandsbehandling i området.
Om patientens anamnes avslöjar att han/hon har tagit hela och korrekt doserade behandlingskuren, kan möjligheten av ett verkligt behandlingsmisslyckande endast uteslutas genom att patienten remitteras till en inrättning med mikroskopi av god kvalitet. Det kan ändå vara nödvändigt att remittera patienten för att erhålla andrahandsbehandling. Hos enskilda patienter är det kanske inte möjligt att skilja rekodescens från återinfektion, men om feber och parasitemi inte försvinner (vid mikroskopering) eller om de återkommer inom fyra veckor efter behandlingen anses behandlingen med den för närvarande rekommenderade ACT-behandlingen ha misslyckats. I dessa fall är den rekommenderade andrahandsbehandlingen en alternativ ACT som är känd för att vara effektiv i regionen. Utöver ovanstående riktlinjer bör vårdgivaren i alla fall alltid överväga andra diagnoser och noga följa upp om det finns ett kliniskt svar.
Förnyad feber och parasitemi mer än fyra veckor efter behandling kan antingen bero på rekrudescens eller på en ny infektion. Skillnaden kan endast göras genom genotypning av parasiter från den första och den återkommande infektionen. Eftersom genotypning av parasiter inte används rutinmässigt i patientbehandlingen bör alla förmodade behandlingsbortfall efter fyra veckors inledande behandling betraktas som nya infektioner och behandlas med första linjens ACT.
Slutsatsen är att resultaten från denna studie tydligt visar att vid aktiv (obehandlad) malariainfektion är det vanligt att HRP2/pan-pLDH-kombinationstester ger ett positivt HRP2-band i kombination med ett negativt pan-pLDH-band vid låga parasittätheter, och när båda banden är positiva är ofta pan-bandet svagt även vid tätheter på 2 000 parasiter/μL. Det skulle därför vara farligt att tolka förekomsten av ett HRP2-band i avsaknad av ett pan-band som att det enbart orsakas av ihållande antigenaemi i en klinisk miljö. Först när känsligheten hos det pLDH-detekterande pan-bandet förbättras så att det får en reaktivitet som är jämförbar med HRP2-bandet när det gäller att detektera P. falciparum, kan man med säkerhet säga att persisterande antigenaemi är orsaken till HRP2-positiva, pan-negativa RDT-resultat.