RNase A: Vanliga frågor | AG Scientific Blog

Introduktion till RNase

Ribonukleaser (RNaser) är en stor grupp hydrolytiska enzymer som bryter ner ribonukleinsyramolekyler (RNA). Det är nukleaser som katalyserar nedbrytningen av RNA till mindre komponenter. De är en superfamilj av enzymer som katalyserar nedbrytningen av RNA och verkar på transkriptions- och översättningsnivåerna.

3D-konformation av ribonukleas A enzym

Dessa enzymer finns i alla levande celler och biologiska vätskor, inklusive prokaryoter och eukaryoter, och utför många viktiga funktioner. RNaser är allestädes närvarande och har en mycket kort livslängd i en oskyddad miljö. De cytotoxiska effekterna omfattar RNA-klyvning som leder till hämning av proteinsyntesen och induktion av apoptos. Dessa cytotoxiska effekter kan produceras genom att applicera RNas på cellens yttre yta, men det har visat sig att cytotoxiciteten ökar 1000-faldigt när enzymet introduceras artificiellt i cytosolen, vilket tyder på att internalisering i cellen är det hastighetsbegränsande steget för toxicitet.

RNaser klassificeras som endoribonukleaser och exoribonukleaser. Endoribonukleaser är formerna A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM och V.

Exoribonukleaser innefattar RNasformerna PH, II, R, D och T samt polynukleotidfosforylas (PNPas), oligoribonukleas, exoribonukleas I och exoribonukleas II. Dessa enzymer klyver olika RNA-arter på olika sätt.

Förnyligen har forskare uppmärksammat RNaser som möjliga medel för cancerbehandling. Tanken är att hitta ett enzym som selektivt skadar cancerceller utan att påverka de omgivande normala cellerna.

RNase A produkter från AG Scientific, Inc.

Vanliga frågor om RNase A

Vad är RNase A?

Ribonukleas A är ett matsmältningsenzym som utsöndras av bukspottkörteln och som specifikt ”smälter” eller hydrolyserar RNA-polymerer (men inte DNA) genom endonukleaseklyvning av de fosfodiesterbindningar som bildar de kovalenta länkarna mellan intilliggande ribonukleotidrester i dessa molekyler.

Vad står ”A” för i RNase A?

Att ”A” i namnet hänvisar inte till dess substratspecificitet utan till den dominerande formen av enzymet som produceras av bovin pankreas. RNas A är omodifierat, medan RNas B, RNas C och RNas D är blandningar av glykoformer.

På grund av att RNas A finns tillgängligt i stor mängd och hög renhet har det varit föremål för banbrytande arbete inom proteinkemi och enzymologi. Dessutom har cytotoxiska varianter och homologer av enzymet visat sig vara användbara som kemoterapeutiska medel.

Vad är detta enzyms historia?

Det användes av Christian Anfinsen för att bevisa att sekvensen av aminosyror, bestämmer strukturen hos ett veckat protein och det användes av Stanford Moore och William Stein för att visa att ett specifikt arrangemang av aminosyror används i det katalytiska centret hos enzymer.

Ribonukleas A var också det första enzym som syntetiserades av R. Bruce Merrifield, vilket visade att biologiska molekyler helt enkelt är kemiska enheter som kan konstrueras artificiellt. Alla dessa centrala begrepp, som upptäcktes med hjälp av ribonukleas, belönades med Nobelpris.

Vad är strukturen på RNas A?

RNasets struktur

Den relativt lilla, 124 aminosyror långa sekvensen av RNas A som har en molekylmassa på 12 600 Da. innehåller fyra His-rester, två av resterna His12 och His119 är direkt inblandade som katalytiska rester i detta enzym. Imidazolringen i His12 har ett anonymt lågt pK-värde (pK < 6,0), vilket tyder på att den måste deprotoneras för katalys. Omvänt har imidazolringen i His119 ett anonymt högt pK-värde (pK > 6,0) vilket tyder på att den måste protoneras för katalysen.

Är Ribonukleas A ett protein?

RNas A är ett litet protein, det mogna enzymet har endast 124 aminosyrarester, utan att någon kolhydrat är knuten. Till skillnad från andra enzymer innehåller RNas A 19 av 20 syror och saknar endast tryptofan.

Vad är verkningsmekanismen?

His12 fungerar som en allmän bas och accepterar 2′-OH-protonen i den fastsittande ribonukleiska sockerringen. Detta främjar en nukleofil attack av 2′-O på den mer positivt laddade fosforatomen (P) och skapar därigenom en 2′-,3′-cyklisk ribonukleotidfosfatintermediat. Skapandet av denna intermediär underlättas av imidazolet i His119 som fungerar som en allmän syra och ger sin proton till syreatomen i den känsliga P-O-R’-bindningen.

För det andra reaktionssteget är de allmänna syra- och basaktiviteterna hos sidokedjorna till dessa två His-rester omvända. His12 agerar som en allmän syra och donerar sin nyförvärvade proton till den 2′-,3′-cykliska ribonukleotidfosfatintermediären, medan His119 som agerar som en allmän bas och tar emot en proton från vatten för att främja en hydroxylattack på samma 2′-,3′–cykliska intermediär.

Vad är klyvningsstället för RNas A?

RNas A hydrolyserar effektivt RNA-kontaminanter i DNA-preparat genom att klyva fosfodiesterbindningen mellan 3′-fosfatgruppen i en pyrimidinnukleotid (C och U) och 5′-ribosen i dess angränsande nukleotid 1, 2, 3. Den mellanliggande 2′-,3′-cykliska fosfodiester som bildas hydrolyseras sedan vidare till en 3′-monofosfatgrupp. Bovint pankreatiskt RNas A är ett mycket stabilt protein på 124 aminosyror med sin högsta uppmätta aktivitet mot enkelsträngat RNA och en två gånger snabbare klyvningshastighet vid cytidinrester jämfört med uridylrester.

Vad är RNas A:s syra/bas-katalysreaktion?

RNas A använder sig också av syra/bas-katalys för att kemiskt ändra sina substrat. Sura eller basiska rester av enzymet överför protoner till eller från reaktanten för att stabilisera de utvecklande laddningarna i övergångstillståndet. Överföringen av protoner skapar vanligtvis bättre avgångsgrupper, vilket gör reaktionen mer energimässigt gynnsam.

Histidin är en mycket vanlig aminosyrarest som är involverad i katalys, eftersom histidin har ett pKa-värde nära neutralt, (pKa=6); därför kan histidin både ta emot och avge protoner vid fysiologiskt pH.

Hur stor är stabiliteten hos Ribonukleas A?

Ribonukleas A är fantastiskt stabilt. I ett förfarande för rening av ribonukleas A från bukspottkörteln från kor behandlas till exempel extrakt med svavelsyra och upphettas sedan nästan till kokning, och ribonukleas A är det enda som överlever. Detta är inte förvånande, eftersom det utsöndras av bukspottkörteln och måste utföra sitt arbete i den ogästvänliga miljön i matsmältningskanalen. Stabiliteten hos ribonukleas A beror till stor del på fyra disulfidlänkar som limmar ihop olika delar av kedjan.

För att bibehålla stabiliteten ska produkten i allmänhet förvaras och hanteras enligt säljarens anvisningar.

Hur inaktiveras RNas A?

RNas A är ett ganska stabilt enzym och innehåller 4 disulfidbryggor, som förekommer i alla däggdjurs bukspottkörtelns ribonukleaser. När broarna bryts reduktivt denatureras proteinet och blir inaktivt. Vid reoxidation återbildas proteinet och fullständig aktivitet återställs. Det är dock möjligt att reducera broarna endast delvis och behålla enzymaktiviteten. Borttagning av 4 peptider vid karboxylterminus förstör enzymaktiviteten.

Vad hämmar RNas A?

Uridinvanadat är en potent kompetitiv hämmare av RNas A. Det som gör den så potent är att dess struktur efterliknar ett övergångstillstånd som är intermediärt i reaktionen.

Hur framställs RNas A från lager?

RNas A framställs vanligtvis genom att koka lagret i 10 minuter för att eliminera den kontaminerande DNasaktiviteten utan att RNaset påverkas. Uppvärmning till 65 °C påverkar inte RNaser.

Hur rekonstitueras beredd stock av RNas A?

RNas A kan lösas upp i en koncentration på 1 till 10 mg/ml i 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 15 mM NaCl, upphettas till 100 °C i 15 minuter för att inaktivera kontaminerande DNaser och kyls långsamt till rumstemperatur och fördelas i alikvots.

Vad är arbetskoncentrationen av detta enzym?

Rekommenderad arbetskoncentration av RNas A är 1 till 100 µg/ml beroende på tillämpningen. Enzymet är aktivt under ett stort antal reaktionsförhållanden. Vid låga saltkoncentrationer (0 till 100 mM NaCl) klyver RNas A enkelsträngat och dubbelsträngat RNA samt RNA-strängen i RNA-DNA-hybrider.

Vad är lagringstemperaturen och hanteringsåtgärderna för denna produkt?

Lagra i tätt förseglad flaska vid -20ºC. När den har öppnats, dehydratisera den över kiselgel under vakuum innan den återförs till -20ºC. Var försiktig vid hantering. Använd inte denna förening om du inte är fullt utbildad eller om du inte är medveten om riskerna.

Vad är användningsområdena för RNas A?

RNaser har viktiga roller vid nedbrytning och omsättning av RNA i alla organismer. Ribonukleasenzym kan avveckla RNA-helixen genom att komplexera med enkelsträngat RNA.

RNas A är ett endoribonukleas med funktioner i RNA-metabolism och reglering av genuttryck.

RNas A har visat sig spela viktiga roller vid sjukdomar som autoimmuna sjukdomar, njurinsufficiens och sjukdomar i bukspottkörteln. På senare tid rapporterades också en antitumöraktivitet för ett RNas A med cytotoxiska och cytostatiska egenskaper. Medlemmarna i RNas A superfamiljen uttrycks i stor utsträckning och finns i serum och vävnader hos däggdjur.

Enzymet kan användas för att hydrolysa RNA från proteinprover. Det är kompatibelt för användning i RNase protection assays, för att avlägsna ospecifikt bundet RNA, vid analys av RNA-sekvenser, för att hydrolysa RNA som finns i proteinprover och vid DNA-rening.

Vilket utseende/form har denna produkt?

Levereras som ett vitt kromatografiskt renat, saltfritt, frystorkat pulver. Produktens utseende/form kan variera beroende på tillverkaren.

Tillkommande läsning

• Källor till DNA-kontaminering i laboratoriet
• Guanidintiocyanat i RNA-lysisbuffertar
• 8 Fördelar med att välja AGS. som din leverantör av proteinas K