Samimmunoprecipitationsanalyser av enstaka molekyler i realtid avslöjar cancerspecifik Ras-signaliseringsdynamik

Realtidsavbildning av sam-IP av enstaka molekyler

Vi visar för det första att kinetiken för en protein-proteininteraktion kan mätas i celextrakt på enstaka molekylnivå (Fig. 1). Som modellinteraktion i en cellsignalväg valde vi interaktionen mellan Ras och Raf, som är det inledande steget i den konserverade MAPK-vägen som är hyperaktiverad i många mänskliga cancerformer5,6,7. Vi använde cRafs Ras-bindande domän (cRafRBD) och en version av HRas som innehåller en enpunktsmutation, Q61L, som gör den konstitutivt aktiv6,8,9,10,11,12. Livecellsavbildningar av HeLa-celler som samuttrycker dessa två proteiner visade en hög nivå av samlokalisering (fig. 1a och kompletterande fig. S2). Vi kunde styra denna samlokalisering med rapamycin-triggad translokation av HRas till plasmamembranet13 , vilket resulterade i samtidig lokalisering av cRafRBD till samma fläckar. Den konventionella co-IP:n gav också ett tydligt westernband, vilket tyder på en selektiv protein-proteininteraktion mellan konstitutivt aktiva HRas och cRafRBD (fig. 1b, vänster). Vi upptäckte dock att detta till synes tydliga proteinband endast innehöll mindre än 5 % av hela bytesproteinerna, vilket tyder på att bytesproteinerna kanske inte är stabilt bundna till beten utan avlägsnas till flödesdelen genom tvättprocesser (fig. 1b, höger och kompletterande fig. S3). Vi noterar vidare att både avbildningen av levande celler och co-IP-metoderna inte kan dissekera den verkliga kinetiken för denna kanske svaga, övergående protein-proteininteraktion.

(a) Studie av co-lokalisering i levande celler för interaktionen HRas-cRafRBD. Protein-proteininteraktioner mellan HRas och cRafRBD bedömdes genom att observera translokaliseringen av cRafRBD till plasmamembranet tillsammans med HRas. CA och DN betecknar den konstitutivt aktiva respektive dominant negativa formen av HRas. Skala, 10 μm. (b) Konventionella co-IP-data för HRas-cRafRBD-interaktionen. För co-IP-analyserna användes GST-cRafRBD (vänster) respektive mCherry-HRas-proteiner (höger) som beten immobiliserade på pärlor. (c) Schematisk bild av co-IP i realtid för single-molecule co-IP. (d) TIRF-bild av immobiliserad mCherry-HRas på ytan. Skala, 10 μm. (e) Successiva bilder från realtidsavbildningen av co-IP med en molekyl i enstaka molekyler. Realtidsspåret av dessa bindningshändelser visas i f och markeras med en röd kvadrat. Skala, 1 μm. (f,g) Exemplariska realtidsspår från realtidsbilder av single-molecule co-IP i realtid. Signalen består huvudsakligen av en diffus bakgrundsfluorescens överlagrad av en sekvens av fluorescensspikar. (h) Ett negativt kontrollexperiment med ytimmobiliserad DN HRas (S17N). (i) Fördelning kbind för experimentet i f. Relevanta kinetiska hastigheter bestämdes med hjälp av en enkel-exponentiell kurvanpassning (heldragna linjer). (j) Ett andra negativt kontrollexperiment med ytimmobiliserat FLAG-eGFP. (k) Fördelning av kdiss för experimentet i f. Och kblinking för experimentet i j. Relevanta kinetiska hastigheter bestämdes med hjälp av en enkel-exponentiell kurvanpassning (heldragna linjer). Felstaplar anger standardfel (s.e.; n>200).

För att visualisera HRas-cRafRBD-interaktionen i realtid på singelmolekylnivå fusionerade vi HRas-genen med det röda fluorescerande proteinet mCherry och vi fusionerade cRafRBD med förstärkt grönt fluorescerande protein (eGFP; fig. 1c). Vi uttryckte varje protein i en separat grupp HEK293-celler. Vi använde strategin med single-molecule pull-down för att immobilisera mCherry-HRas på ytan2,3 (fig. 1c). Vi injicerade sedan det andra helcellslysatet som innehöll eGFP-cRafRBD på den immobiliserade mCherry-HRas-ytan som i en konventionell co-IP (fig. 1c). Vi använde ett TIR-mikroskop (total internal reflection) för att generera ett evanescent elektriskt fält som selektivt exciterade eGFP-cRafRBDs som kom inom 100 nm från ytan. För att observera svaga protein-proteininteraktioner övervakades enskilda eGFP-cRafRBDs ankomst till ytan i realtid med det andra helcellslysatet som bibehölls i kammaren (fig. 1c).

Figur 1f visar en typisk realtidsspårning av denna co-IP-preparering med enstaka molekyler. Varje spår producerades genom att integrera fluorescenssignalen över en cirkulär region av intresse (ROI) med en yta på 1,1 μm2 (fig. 1e). Vi kontrollerade yttätheten av mCherry-HRas för att upprätthålla ett genomsnitt på 0,5 HRas-molekyler per ROI (Supplementary Fig. S4). Vi använde också gaussisk filtrering under signalintegrationen och ett strikt tröskelvärde för signaldetektion för att säkerställa att realtidsspåren rapporterade bindningshändelserna för enskilda HRas-proteiner (fig. 1g och kompletterande fig. S5). Varje realtidsspår består tydligt av två delar: en bakgrundsfluorescens och enskilda fluorescensspikar. Varje eGFP-cRafRBD-molekyl, som rör sig enligt Brownsk rörelse, bör tillbringa mindre än 50 μs per besök i TIR-exciteringsskiktet. Eftersom 50 μs är tre storleksordningar kortare än vår avbildningsapparats tidsupplösning (50 ms), ger den Brownska rörelsen hos många eGFP-cRafRBD-molekyler en konstant nivå för bakgrundsfluorescensen. De enskilda fluorescensspikarna visar däremot att en enskild eGFP-cRafRBD har interagerat med en molekyl på ytan tillräckligt länge för att överleva signalintegrationen på 50 ms.

Nästan analyserade vi den väsentliga kinetiken för denna protein-proteininteraktion genom att analysera τoff, tiden mellan bindningshändelserna, och τon, varaktigheten av en enskild bindningshändelse (fig. 1g). Genom att anpassa enkla exponentiella ekvationer till τoff- och τon-fördelningarna får man kinetiska hastigheter för kbind respektive kdiss. För att säkerställa att fluorescensspikarna verkligen är resultatet av en specifik HRas-cRafRBD-interaktion utförde vi samma eGFP-cRafRBD-bindningsexperiment med ytimmobiliserad dominant negativ HRas (S17N), som har en minskad affinitet till GTP14,15. Med den dominerande negativa formen minskade fluorescensspikfrekvensen (kbind) kraftigt (fig. 1h). Denna negativa kontroll bevisar att fluorescensspikarna varken är artefakter av enkel ytadsorption av eGFP-cRafRBD eller beror på ytimmobilisering av andra proteiner med falska eGFP-cRafRBD-interaktioner. Istället rapporterar dessa fluorescensspikar troget HRas-cRafRBD-bindningshändelserna.

Det är också anmärkningsvärt att varaktigheten av en enskild bindningshändelse typiskt sett bara varar några hundra ms (fig. 1f). Vi studerade blinkningsdynamiken hos FLAG-eGFP16 som immobiliserats på en yta med en anti-FLAG-antikropp (fig. 1j). Fotoblinkning av FLAG-eGFP sker i genomsnitt med några sekunders mellanrum, vilket ger en kinetisk hastighet som är mindre än 0,3 s-1, och denna eGFP-fotoblinkningshastighet är en storleksordning långsammare än den kdiss vi mätte (fig. 1k). Dessutom validerade vi på nytt alla kinetiska hastigheter för kbind och kdiss i en enda molekyl med hjälp av ett kriterium för samlokalisering som krävde samlokalisering av fluorescenssignaler från mCherry-HRas- och eGFP-cRafRBD-proteinerna (Supplementary Fig. S6). Således måste HRas-cRafRBD-interaktionen verkligen ha en snabb omsättning, några gånger per sekund11,12.

Visualisering av möteskomplex i Ras-Raf-interaktion

En detaljerad analys av HRas-cRafRBD-bindningsfrekvensen (kbind) visar att det finns snabba pre-equilibrerande möteskomplex17,18,19,20,21, som är lösa protein-proteininteraktionsintermediärer som bör befolkas innan det slutgiltiga HRas-cRafRBD-komplexet bildas (fig. 2). När vi ökade koncentrationen av eGFP-cRafRBD från 5 till 50 nM visade kbind en parabolisk ökning (fig. 2a), som bäst kan anpassas till ekvationen med en Hillkoefficient (n) på 1,1 (22,23), en dissociationskonstant (K1) på 43 nM för bildning av encounterkomplex och en κon på 2.16 s-1 nM-1, vilket är den kinetiska hastigheten för att bilda det slutliga bundna tillståndet från ett mötekomplex (kompletterande metoder och kompletterande figur S7). kdiss är å andra sidan i stort sett konstant för de eGFP-cRafRBD-koncentrationer vi studerade (figur 2b). Dessa kinetiska hastigheter som uppmättes med vår realtids single-molecule co-IP stämmer väl överens med tidigare rapporter med hjälp av biokemiska massanalyser (kompletterande tabell S1). En anmärkning är att vi har antagit en dominerande konformation för det slutliga HRas-cRafRBD-komplexet. Även om vårt antagande bekräftas av de unimodala fördelningarna av fluorescensspikintensiteten (Supplementary Fig. S8) kan vi inte helt utesluta möjligheten att det finns flera konformationer för HRas-cRafRBD-komplexet med flera vägar som leder till dem.

(a) kbind som en funktion av cRafRBD-koncentrationen. En linjär ökning av kbind visas som jämförelse. (b) kdiss som en funktion av cRafRBD-koncentrationen. kblinking från experimentet i fig. 1j visas som en jämförelse. Felstaplar anger s.e. (n>180). (c-e) Realtidsspår av HRas-cRafRBD-interaktion. Observera att bakgrundsfluorescensen ökar med HRas-tätheten på ytan. Vi använde samma byteskoncentration på =10 nM. (f) Ökning av bakgrundsfluorescensen som en funktion av HRas-tätheten på ytan. Tre dataset, erhållna med 10 nM (röda cirklar), 20 nM (gröna trianglar) eGFP-cRafRBD och 20 nM rekombinant eGFP (blå diamanter), är normaliserade med motsvarande bakgrundsfluorescensnivå uppmätt vid en låg Ras-täthet på ytan på 0,38 HRas per μm2. Felstaplar anger s.d. (n>100). (g) Spikfrekvens för enskilda molekyler som en funktion av bakgrundsfluorescensen. Datasetet som erhållits med 10 nM eGFP-cRafRBD används. Felstaplar anger s.e. (n>100).

Märkligt nog kan vi visualisera möteskomplexen genom att variera ytdensiteten av HRas. Om bakgrundsfluorescensen är en enkel produkt av den Brownska rörelsen av eGFP-cRafRBD skulle den enbart bero på bulkkoncentrationen av cRafRBD. Bakgrundsfluorescensen ökar dock brant med ytdensiteten av HRas även om cRafRBD-koncentrationerna hålls konstanta (fig. 2c-f). Vid en hög Ras-täthet på 6,4 HRas per μm2 blir den totala bakgrundsfluorescensen tre gånger så hög som den som observeras vid 0,38 HRas per μm2 (fig. 2c). Vår numeriska simulering visar att förekomsten av parallella bindningsprocesser i en given ROI endast kan förklara mindre än 5 % av den observerade ökningen (kompletterande figur S9). När bytesproteinerna byttes ut mot rekombinanta eGFP:er, som inte interagerade med ytimmobiliserade HRas-proteiner, var deras bakgrundsfluorescens dessutom i stort sett oföränderlig i det HRas-täthetsområde som vi studerade (fig. 2f, blå diamanter). Eftersom vi har en tät population av aktiva HRas-proteiner på ytan verkar det alltså faktiskt finnas fler eGFP-cRafRBD-molekyler som dröjer sig kvar ovanför ytan än vad som skulle förväntas av ren Brownsk diffusion. Dessa möteskomplex uppstår genom snabba pre-equilibrerande interaktioner mellan HRas- och cRafRBD-proteiner24 , vars dynamik ligger utanför vår tidsmässiga upplösning.

Vi frågade oss sedan om möteskomplexen verkligen tjänar som substrat för det slutgiltiga HRas-cRafRBD-komplexet. För detta ändamål bedömde vi frekvensen av fluorescensspikar som genereras av ett enda ytimmobiliserat HRas-protein. Vi har resonerat att om möteskomplexen verkligen är på väg intermediärer för det slutliga Ras-Raf-komplexet, bör spikfrekvensen för enstaka molekyler öka med den ökande bakgrundsfluorescensen trots samma bulkkoncentration av cRafRBD. För att få fram singelmolekylspikfrekvensen i HRas-täta miljöer mätte vi kbind med hjälp av en mindre 3 x 3 pixel ROI (0,18 μm2) och dividerade det uppmätta kbind-värdet med det genomsnittliga antalet HRas i varje 3 x 3 pixel ROI (Supplementary Fig. S10). I stort sett ökade denna spikfrekvens för enstaka molekyler med bakgrundsfluorescensen (fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD användes). Vår observation tyder på att de koncentrerade nedströmsproteinerna i form av möteskomplex leder till att Ras-Raf-komplexet bildas med ökad frekvens.

Single-molecule co-IP-analys av signalproteiner i cancer

Vi har hittills demonstrerat realtidsmätning av protein-proteininteraktionskinetik under single-molecule co-IP. I dessa experiment är dock bete- och bytesproteinerna fusionerade med fluorescerande proteintaggar, vilket ställer frågan om vi kan utvidga denna teknik till nativa proteiner. I detta syfte uttryckte vi muterad HRas (G12V) i en icke-tumörbildande mänsklig bröstepitelcellinje (MCF10A) för att omvandla dem till cancerceller25 (fig. 3a). Dessa transformerade celler, som visade serumfri tillväxt (kompletterande figur S11), bildade tumörer när de injicerades i bröstfettet hos immunsupprimerade möss (figur 3b). Tumörvävnader erhölls 17 dagar efter xenograftningen, och kontrollvävnader framställdes från samma delar av obehandlade nakenmöss.

(a,b) Omvandling av MCF10A-celler till cancerceller genom retroviral HRas (G12V) transduktion. Denna singelpunktsmutation är känd för att göra HRas konstitutivt aktiv. Injicering av cancerceller i bröstkorgar hos nakna möss leder till tumörbildning. Skala, 5 mm. (c) Schematisk bild av western blot-analys av enstaka molekyler. Konkurrens mellan cellulär och probe Ras för bindning till den primära antikroppen minskar antalet probe Ras som är specifikt bundna till ytan, vilket följaktligen minskar antalet fluorescerande fläckar. Observera att eftersom varje primär antikropp binder till två Ras-proteiner, försvinner en fluorescerande fläck när båda de två ljuskedjearmarna är upptagna av cellulär Ras. (d) Prototypisk western blot-mätning med enstaka molekyler. 298 nM mCherry-HRas användes som målprotein. Med 32,5 nM eGFP-HRas som sond mättes målproteinkoncentrationen till 288±1,4 nM. Felmarkeringen anger s.d. (n=20). (e) Ras-uttrycksnivåer som mäts genom tumörigenesiprocessen från a,b. Felstaplar anger s.d. (n=20). (f) Schematisk bild av co-IP-bildtagning i realtid för nativt HRas. (g-j) Spår i realtid av co-IP-avbildning. De HRas-koncentrationer som användes för pull down är 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) och 49 nM (j). Frekvensen av fluorescensspikar ökade signifikant för cancervävnadsextraktet när HRas pull-down ökades från 1,6 till 22 HRas per μm2 (g jämfört med h). Detta observerades inte med kontrollvävnadsextraktet (i jämfört med j). (k) Schematisk bild av kbind-inflationen. Under glesa förhållanden med aktiva beten på ytan erhålls en konstant, enkelmolekylär kbindning även när ytans dragning av beten ökar (de två vänstra panelerna). Efter tröskelvärdet på 0,6 aktiva beten per μm2 finns det dock i genomsnitt mer än ett bete per ROI. Dessa flera beten har effekten att kbind mätt från varje ROI ökar (högra panelen). (l) kbind som en funktion av HRas pull-down. Error bars denote s.e. (n>180).

I ett försök att beskriva denna tumörigenes kvantitativt använde vi tandemskikt av antikroppar; en ytimmobiliserad biotinylerad sekundär antikropp och en Ras-specifik primär antikropp1,2. Detta gjorde det möjligt att fånga upp både naturligt, omärkt Ras och märkt Ras (fig. 3c). Vi spårade först Ras-uttrycksnivåer kvantitativt genom tumörigenesiprocessen. Cell- eller vävnadsextrakt blandades med ett utspätt HEK293-celllysat som innehöll probe Ras (eGFP-HRas) med känd koncentration. Under reaktionsförhållanden som fullt ut mättar den primära antikroppens bindningsställen leder denna blandning till en konkurrens för Ras-specifik antikroppsbindning mellan sonden Ras och målcellens Ras (fig. 3c, vänster). Antalet Ras-molekyler som är bundna till de primära antikropparna minskar i takt med att koncentrationen av målcellens Ras ökar. Denna konkurrerande bindning minskar antalet fluorescensfläckar på ytan (fig. 3c, höger), vilket följer ekvationen när det normaliseras till ett tillstånd med enbart probe Ras-bindning (kompletterande fig. S12). Genom att mäta antalet bundna sondmolekyler vid flera olika spädningar kunde vi specifikt och robust mäta den molära koncentrationen av målcellens Ras i cell- och vävnadsextrakt (fig. 3d och kompletterande fig. S12). Denna western blot-analys med enstaka molekyler visade på Ras-uttrycksnivåer på 42 och 59 nM i 1 mg ml-1 extrakt av cancercellerna MCF10A respektive xenograft-tumörvävnader, medan en grundnivå på 7 nM uppmättes i 1 mg ml-1 extrakt av kontrollvävnaden (fig. 3e).

Fortfarande kunde vi också replikera sam-IP-bildtagningen med enstaka molekyler i realtid från figurerna 1 och 2 på denna infödda yta för Ras-fångning. Efter att ha dragit ner HRas från tumör- eller kontrollvävnadsextrakt på tandemantikroppsytan applicerade vi ett sondcellslysat, ett utspätt HEK293-celllysat med 20 nM eGFP-cRafRBD bytesproteiner (fig. 3f). Vi analyserade co-IP-spår i realtid för att bestämma de kinetiska hastigheterna kbind och kdiss (fig. 3g-j). Det är viktigt att notera att koncentrationsinformationen från single-molecule western blot-analysen (fig. 3e) var avgörande för att säkerställa en specificerad HRas-koncentration för varje pull down när tumör- och kontrollvävnadsextrakten hade disparata HRas-uttrycksnivåer. Med hjälp av kalibreringsdata för pull-down på ytan (kompletterande figur S13) omvandlades slutligen koncentrationsinformationen till en specifik yttäthet av neddragna HRas-proteiner (figur 3g-j).

Vi studerade systematiskt förändringen av kbind samtidigt som vi exakt ökade yttätheten av neddragna HRas-proteiner (figur 3k). Vi antar att som ett resultat av cellulär reglering bör endast en delmängd av HRas-proteinerna på ytan vara i GTP-laddat tillstånd och visa aktiva bindningshändelser med bytesproteinerna. Under ett sparsamt tillstånd där avståndet mellan angränsande aktiva HRas-molekyler är mycket större än diametern för varje ROI, bör den observerade kinetiken från varje ROI vara oberoende av den totala HRas-immobiliseringen på ytan och helt enkelt rapportera aktiviteten hos enskilda HRas-proteiner (fig. 3k, de två vänstra panelerna och kompletterande fig. S14). När ytan blir mer fylld med aktiva HRas bör det finnas en tröskel vid vilken det börjar finnas mer än en aktiv HRas-molekyl per ROI. När detta tröskelvärde har passerats skulle de extra aktiva HRas-molekylerna i varje ROI ge upphov till ytterligare fluorescensspikar som följaktligen skulle blåsa upp kbind (fig. 3k, högra panelen och kompletterande fig. S14). Vi observerade faktiskt en sådan bifasisk trend för kbind för tumörvävnaden, med en tröskel vid ~3 HRas-molekyler som drogs ner per μm2 (fig. 3l).

Under tröskelvärdet för uppblåst kbind skulle den observerade kinetiken för spikar alltså till stor del återspegla aktiviteten hos enskilda HRas-molekyler. Särskilt noterbart är att vid 1,6-1,9 HRas som dras ner per μm2 observerades liknande kbind-värden på 0,28 s-1 och 0,22 s-1 för HRas-proteiner som härrör från tumör- och kontrollvävnad, respektive (fig. 3l). Kdiss-mätningarna var också mycket likartade vid 2,5 s-1 (kompletterande figur S15). Den tumördrivna enskilda onkogena HRas-proteinet hade följaktligen en skenbar dissociationskonstant på 180 nM, och detta var mycket likt dissociationskonstanten på 230 nM för den aktiva HRas-proteinet från vävnadsextraktet från kontrollvävnad. Våra observationer visar på ett avgörande faktum, nämligen att den onkogena HRas-aktiviteten i en enda molekyl inte skiljer sig dramatiskt från den för en aktiverad HRas av vildtyp.

Vad är det då som skiljer detta cancertillstånd från det normala tillståndet? Tröskelvärdet för kbind-inflationen gör det möjligt för oss att kvantifiera en annan viktig statistik över proteiner för cellsignalering, nämligen andelen HRas-proteiner som aktivt binder till cRafRBD. Intuitivt sett bör tröskelvärdet för kbind-inflation motsvara en specifik yttäthet av ”aktiva” betesproteiner. I vårt avbildningsschema visade sig denna tröskel ligga på 0,6 aktiva beten per μm2, vilket inte beror på de detaljerade typerna av betes- och bytesproteiner (Supplementary Fig. S13). Eftersom tröskeln för kbind-inflation observerades vid totalt 3 HRas som drogs ner per μm2, uppskattades fraktionen aktiva HRas direkt till cirka 20 % för tumörvävnaden. Däremot kunde vi inte observera kbind-inflation när även 25 HRas-proteiner drogs ner per μm2 från kontrollvävnaden (fig. 3l). Dessa observationer tyder på att det onkogena HRas som härrör från tumörvävnad har en högre aktiv fraktion än det HRas som härrör från kontrollvävnad med en storleksordning.

Vi frågade oss slutligen om denna högre andel aktivt Ras skulle kunna vara en enkel konsekvens av HRas-överuttrycket i den xenograferade tumören. De överuttryckta HRas-proteinerna skulle kunna vara fler än de putativa bindningspartners som lämnas tillgängliga för bindning till eGFP-märkt Raf. För att direkt besvara denna fråga testade vi två humana bröstcancercellinjer, MCF-7 som har KRas av vildtyp och MDA-MB-231 som har en muterad form av KRas (G13D; fig. 4). Särskilt MDA-MB-231-cellerna är kända för att uppvisa onkogenberoende av den muterade KRas-genen och är kritiskt beroende av avvikande KRas-signalering för sin överlevnad26,27. Genom att använda dessa två cellinjer kan vi också fastställa om våra metoder är tillämpliga på KRas-signalering, som har central betydelse för den molekylära diagnostiken och behandlingen av många mänskliga cancerformer28.

(a,b) Western blot-analyser av uttrycksnivåerna för KRas med en enda molekyl. eGFP-märkt KRas användes som probe Ras. Uttrycksnivån för KRas av vildtyp i MCF-7-linjen uppmättes till 17,3±1,3 nM, medan uttrycksnivån för G13D-mutanten KRas i MDA-MB-231-linjen uppmättes till 5,5±0,3 nM per 1 mg ml-1 extrakt. Felstaplarna anger s.d. (n=200). (c) kbind som en funktion av KRas pull down. Notera samma kbind-värde som delas av vildtypen och mutanten KRas i kinetikområdet för enstaka molekyler (den gemensamma platta linjen). Tröskelvärdet för kbind uppmättes till 1,2 neddragna KRas per μm2 för mutanten KRas från MDA-MB-231, vilket gav en uppskattad aktiv fraktion på 50 %. Detta värde var en storleksordning högre än 6 % för vildtypen KRas från MCF-7, vars tröskelvärde var 10 KRas som drogs ner per μm2. Felstaplar anger s.e. (n>150).

Vi drog direkt ner KRas från dessa celextrakt genom att använda en KRas-specifik primär antikropp. Vår single-molecule western blot-analys visade att vildtypen KRas i MCF-7-celler har en högre koncentration (17 nM) än mutanten KRas i MDA-MB-231-celler (5,5 nM i 1 mg ml-1 extrakt; Fig. 4a och Supplementary Fig. S16). Med tanke på MDA-MB-231-cellernas KRas-onkogenberoende var deras lägre KRas-uttrycksnivå en ganska oväntad observation. Dessutom är singelmolekylsignaleringskinetiken för vildtypen och mutanten KRas i huvudsak densamma (fig. 4c, den gemensamma platta linjen; se kompletterande fig. S15 för kdiss). Å andra sidan löser vår realtids single-molecule co-IP att tröskeln för kbind-inflation för mutanten KRas från MDA-MB-231 identifieras vid 1,2 KRas som dras ner per μm2, medan tröskeln observeras ligga vid ~10 KRas som dras ner per μm2 för vildtypen KRas från MCF-7 (fig. 4c). Eftersom kbind-inflationen alltid sker vid 0,6 aktiva beten per μm2 visar dessa disparata trösklar direkt att den aktiva fraktionen av den muterade KRas som starkt binder till sitt nedströmsmål (15 nM cRafRBD) är 50 %, vilket är nästan en storleksordning högre än de 6 % som visades av vildtypen KRas. Den högre aktiva fraktion som uppvisas av den onkogena muterade Ras är alltså helt klart inte en artefakt av överuttryck, eftersom den muterade KRas uttrycks på lägre nivåer, men uppvisar en högre aktiv fraktion än den vilda typen.