Sura omvandlingar av nordiazepam kan påverka uppskattningen av återvinningen vid spåranalys av diazepam och nordiazepam i miljövattenprover med hjälp av vätskekromatografi-tandem-masspektrometri

Vätskekromatografi-tandem-kvadrupol-masspektrometri-systemen

Det utvecklade isokratiska såväl som det utvecklade gradient-elueringssystemet gav en god toppupplösning (Rs ≥ 3,1) för diazepam och nordiazepam. I det isokratiska systemet var retentionstiderna 2,6 min (0,54 RSD %) och 4,1 min (0,27 RSD %) för standarder av nordiazepam-d5 respektive diazepam-d5. I ytvattenmatrisen var retentionstiderna desamma som för standarderna och RSD-värdena var 0,62 % och 0,30 % för nordiazepam-d5 respektive diazepam-d5. Retentionstiderna för arbetsstandarderna i gradientsystemet var 2,4 min (0,90 RSD %) och 2,9 min (0,70 RSD %) för nordiazepam respektive diazepam. Precisionen av retentionstiderna för föreningarna i behandlat avloppsvatten anges i tabell 1, där RSD-värdena var ≤ 0,35 %.

Diazepam och nordiazepam identifierades i proverna av behandlat avloppsvatten genom deras karakteristiska MS/MS-övergångar och retentionstider (tabell 1). En prekursorjon och två fragmentjoner övervakades för varje förening. För att identifiera ”naturligt” förekommande diazepam och nordiazepam jämfördes förhållandet mellan de toppområden som erhållits från de två fragmentjonerna med förhållandena för standarderna (tabell 1). Dessutom jämfördes retentionstiderna för målföreningarna med retentionstiderna för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 i samma kromatografiska körning.

Utveckling av fastfasextraktionsmetoden

Stabiliteten hos diazepam och nordiazepam i sura och neutrala vattenprover

Insamlade miljövattenprover förvaras vanligen vid surt pH innan de analyseras med avseende på nya föroreningar . I denna studie studerades stabiliteten hos diazepam och nordiazepam när de förvarades som arbetsstandarder (vid pH 3,1 och pH 7,0). Det visade sig att nordiazepam i stor utsträckning bröts ned när det förvarades i den sura lösningen vid rumstemperatur. Inom 12 dagar var 56 % av nordiazepam nedbrutet (fig. 2). Nedbrytningen var inte lika omfattande när arbetslösningen förvarades vid 4 °C; efter 12 dagar hade 20 % av den ursprungliga koncentrationen av nordiazepam nedbrutet. Diazepam visade sig däremot vara stabilt vid pH 3,1 när det förvarades i rumstemperatur och vid 4 °C (fig. 2). Under de 12 dagarna hade endast 0,53 % och 3,1 % av diazepam byggts ned vid rumstemperatur respektive vid 4 °C. Båda föreningarna visade sig vara stabila i 12 dagar vid neutralt pH. Vid dag 12 var svaren för diazepam och nordiazepam (när de förvarades vid 4 °C och rumstemperatur) 101-103 % av de ursprungliga svaren. RSD-värdena (n = 3) för den bestämda koncentrationen vid olika tidpunkter var ≤ 5,1 %. Reaktionen upptäcktes ursprungligen i avloppsvattenprover, men experimenten utfördes i förberedda lösningar för att förenkla förhållandena och minska möjligheten till andra reaktioner/effekter i avloppsvattnets mycket komplexa matriser.

Stabiliteten hos diazepam och nordiazepam i 5 mM myrsyra i renat vatten, pH 3. Diazepam förvarat vid 4 °C (vit triangel) och i rumstemperatur (svart triangel). Nordiazepam lagras vid 4 °C (vit fyrkant) och i rumstemperatur (svart fyrkant). Experimentella detaljer beskrivs i ”Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions”

Våra resultat visar att nordiazepam är instabilt vid pH 3. Dessa resultat överensstämmer med resultat i litteraturen som visar att nordiazepam genomgår hydrolys i sura lösningar. Archontaki et al. fann att nordiazepam hydrolyserades i sura vattenlösningar och att det första steget i nedbrytningen var reversibelt. Resultaten i den aktuella studien kan dock tyckas strida mot resultaten från en nyligen genomförd studie där man fann att nordiazepam (och diazepam) var mer stabilt vid pH 2 än vid pH 7 . Skillnaden är faktiskt förväntad när man beaktar de olika strategierna för bestämning av återvinning. Eftersom omvandlingen av nordiazepam vänds vid avdunstning och uppvärmning kan det inte ha någon praktisk betydelse för rutinmässig användning av metoden. Det är först när återvinningen uppskattas enligt rekommendationerna från Matuszewski et al. i kombination med nordiazepams instabilitet vid lågt pH som vi får en förlust av föreningen och därmed en skenbart hög återvinning.

Återvinningen vid fastfasextraktion för simulerade miljövattenprover som förvarats vid lågt pH

Återvinningen vid fastfasextraktion och matriseffekten bestämdes i behandlade vattenprover med hjälp av LC-MS genom att använda det tillvägagångssätt som föreslogs av Matuszewski et al. , närmare uppgifter finns i ”Validering av metoden”. Extraktionsåtervinningen bestämdes för de isotopmärkta standarderna diazepam-d5 och nordiazepam-d5, eftersom märkta föreningar inte förväntas förekomma i miljömatriserna. I denna studie förvarades arbetsstandarderna för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 i 5 mM myrsyra i renat vatten pH 3,1/acetonitril (90/10, v/v) i högst en vecka vid 8 °C och användes för att bereda uppsättningar A-C.

Den relativa extraktionsåtervinningen, som bestämdes vid en låg och en hög koncentration, anges i tabell 2 (extraktionsmetoden anges i ”Provberedning och extraktion i fast fas”). Extraktionsåtervinningarna var högre för nordiazepam-d5 än för diazepam-d5. För nordiazepam-d5 var den relativa extraktionsåtervinningen 114 ± 8,1 % och 117 ± 21 % vid låg respektive hög koncentration. RSD-värdena för diazepam-d5 var 6,0 % och 24 % för den låga respektive höga koncentrationen (tabell 2). Höga RSD-värden (≥ 18 %) för extraktionsförfarandet i fast fas erhålls ibland vid spårnivåbestämningar i komplexa matriser . Dessutom har höga extraktionsåtervinningar (≥ 100 %) för nordiazepam i miljövattenprover tidigare rapporterats i litteraturen . Som kommer att diskuteras nedan kan de höga återvinningarna korreleras med en kemisk jämvikt mellan nordiazepam och en omvandlingsprodukt.

Den absoluta extraktionsåtervinningen för nordiazepam-d5 fastställdes till 139 ± 21 % och matriseffekten till 119 ± 3,0 %. Den höga absoluta extraktionsåtervinningen för nordiazepam-d5 kan delvis förklaras av att nordiazepam-d5 utsattes för jonförstärkning i MS-gränssnittet. Vi visade dock att de höga extraktionsåtervinningarna (> 100 % för den relativa extraktionen, som diskuterats ovan) inte bara orsakades av matris effekter i ESI-källan. Detta fastställdes genom de relativa extraktionsåtervinningar som erhölls enligt Matuszewski et al. där de extraherade och de icke-extraherade proverna injicerades i LC-MS/MS-systemet upplösta i samma matris. För att ytterligare verifiera att de höga extraktionsåtervinningarna inte var korrelerade med någon process i masspektrometerns gränssnitt bestämdes dessutom extraktionsåtervinningarna för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 med hjälp av en andra detektionsteknik, LC-UV. Återvinningen för ett extraherat prov av nordiazepam-d5 i fosfatbuffert (pH 7,0) som analyserats med både LC-MS/MS och LC-UV fastställdes till 159 respektive 153 % (n = 2). Vi drog slutsatsen att de höga extraktionsåtervinningarna för nordiazepam inte till stor del tillskrivs någon process i masspektrometern.

Slutsatsen är att även om de erhållna extraktionsåtervinningarna och RSD-värdena var höga, skulle de troligen framstå som rimliga eftersom koncentrationerna av målföreningarna var låga (50 och 250 pM) och eftersom föreningarna extraherades från en komplex matris. I den här studien ville vi visa att dessa höga återvinningar som erhållits för nordiazepam kan korreleras till en kemisk jämvikt mellan nordiazepam och en omvandlingsprodukt som Archontaki et al. fann.

Regenerering av nordiazepam under provberedning

När förvarade lösningar av diazepam och nordiazepam (pH 3.1, vid rumstemperatur, ”The stability of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous samples”) användes för att spetsa fosfatbufferten och sedan utsattes för extraktion i fast fas, var de svar som erhölls från de rekonstituerade extrakten av nordiazepam större jämfört med de svar som erhölls från de oextraherade lagrade lösningarna. Vid extraktionen i fast fas hade toppområdet för nordiazepam ökat från 26 area counts (2,7 RSD %, n = 3) till 45 area counts (14,6 RSD %, n = 3).

För att verifiera att nordiazepam regenererades under fastfasextraktionen injicerades ett lagrat prov av nordiazepam-d5 (som gav en toppyta på 1470 för fragmentjonen m/z 213) och ett bearbetat prov av nordiazepam-d5 (med en toppyta på 1790) i LC-MS/MS-systemet. Förutom SRM-kanalen för nordiazepam-d5 (276 → 213) förvärvades ytterligare två SRM-kanaler, tabell 1. De lagrade proverna av nordiazepam-d5 injicerades (n = 6) och förhållandet mellan SRM-övergångarna fastställdes till 1,4 (3,8 RSD %, fragmentjonförhållande m/z (276 → 213)/(276 → 165) och 1,0 (3,5 RSD %, fragmentjonförhållande m/z (276 → 213)/(276 → 140). För det bearbetade provet av nordiazepam-d5 var förhållandet mellan SRM-övergångarna detsamma, dvs. 1,4 och 1,0. Det fanns alltså inga signifikanta skillnader i fragmentjonförhållandena mellan de lagrade och de bearbetade proverna. Dessutom var retentionstiderna desamma för båda proverna. Man drog slutsatsen att det var nordiazepam-d5 som påvisades i både de lagrade och bearbetade proverna.

Archontaki et al. fann att nordiazepam omvandlades i sur vattenlösning till intermediären N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid med molekylformeln C15H13N2O2Cl och den monoisotopiska massan 288,1 Da. Transformationsprodukten kristalliserades och analyserades med LC-UV, GC-MS, 1H- och 13C-NMR och IR-spektroskopi. Den kemiska jämvikten mellan intermediären och nordiazepam var reversibel, men den fortsatta omvandlingen av intermediären till den slutliga nedbrytningsprodukten (C13H10NOCl) var dock inte reversibel. I denna studie upptäcktes en jon med en retentionstid på 3,0 minuter och ett mass-till-laddningsförhållande på 289,0 med LC-MS i en lagrad lösning (pH 3,1) av nordiazepam. Denna jon kan motsvara + av nordiazepams omvandlingsprodukt. Dessutom motsvarade isotopmönstret för jonen vid 3,0 min isotopmönstret för en kloratom. Dessutom eluerades den kromatografiska toppen före nordiazepam, vilket stämmer överens med resultaten från separationen av nordiazepam och N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid i det omvänt fas-system som Archontaki et al. använde sig av. Den upptäckta toppen i den lagrade sura vattenlösningen i den här studien var alltså troligen N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid. Förhållandet mellan nordiazepam och N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid var dessutom 0,75 (n = 2) i denna lagrade vattenlösning i den aktuella studien. I de avdunsta metanolblandningarna (experimentella detaljer beskrivs i ”Stabilitetsstudier av diazepam och nordiazepam i sura och neutrala vattenlösningar”) ökade dock kvoten mellan nordiazepam och N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid till 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), dvs, toppområdet för nordiazepam ökade och toppområdet för N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid minskade i jämförelse med det prov som inte förångades. Inga toppar upptäcktes för N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid eller nordiazepam i blankprovet. Dessa resultat tyder starkt på att den kemiska jämvikten mellan nordiazepam och den omvandlingsprodukt av nordiazepam som Archontaki et al. karakteriserat skiftade från N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid till nordiazepam under avdunstningen av SPE-extrakten. Ingen topp upptäcktes som kunde korreleras med den slutliga nedbrytningsprodukten (C13H10NOCl) av nordiazepam.

Det drogs slutsatsen att nordiazepam lätt omvandlades till N-(2-benzoyl-4-klorfenyl)-2-aminoacetamid i den sura vattenlösningen. Intressant nog regenererades nordiazepam under processen med extraktion i fast fas. Genom att använda de lagrade lösningarna av nordiazepam vid pH 3,0 som referens vid beräkningarna av extraktionsåtervinningen överskattas återvinningen. Dessa resultat är viktiga vid metodvalidering, dvs. vid bedömningar av lagringsförhållanden, extraktionsåtervinningar och matris effekter. Dessutom kan omvandlingen av nordiazepam påverka de övergripande analysresultaten om en isotopmärkt analog till nordiazepam inte används som intern standard. Det måste också betonas att omvandlingen av nordiazepam kan påverka metodens noggrannhet, inte bara under lagring före extraktion i fast fas, utan också beroende på pH-värdet i den lösning som används, t.ex. vid rekonstituering av de torkade SPE-extrakten.

Metodvalidering

Den utvecklade metoden validerades genom användning av isotopmärkta analoger, diazepam-d5 och nordiazepam-d5 (”Metodvalidering”), eftersom dessa föreningar inte påvisades i miljöproverna. Fördelen med att använda märkta analoger för metodvalidering är att metoden kan valideras på spårnivå i den faktiska matris i vilken analyterna kvantifieras. De relativa extraktionsåtervinningarna i de behandlade avloppsvattenproverna var ≥ 87 % för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 vid hög och låg koncentration (tabell 3). De erhållna värdena ligger inom de områden som kan förväntas när koncentrationer av läkemedel på spårnivå extraheras från komplexa matriser . De absoluta extraktionsåtervinningarna var lägre, 63-86 %, eftersom analyterna utsattes för jonundertryckning (tabell 3). Vid den låga koncentrationen var matrixeffekterna (ME %) 76 ± 14 % och 88 ± 14 % för diazepam-d5 respektive nordiazepam-d5 (tabell 3). Vid den höga koncentrationen låg matrisens effekt och RSD-värdena i samma intervall som vid den låga koncentrationen. Dessa siffror för ME % ligger inom det acceptabla intervallet, eftersom resultaten från andra undersökningar visar att matrisverkan som erhålls med miljövattenmatriser kan vara relativt hög. Metodens noggrannhet fastställdes genom bestämning av SPE-återvinningen vid låg och hög koncentration av diazepam-d5 och nordiazepam-d5 (tabell 3). De relativa återvinningarna var 88 ± 7,6 % och 87 ± 12 % för diazepam-d5 vid låg respektive hög koncentration och 98 ± 7,8 % och 99 ± 6,1 % för nordiazepam-d5.

Kromatografisystemets precision, uttryckt som RSD-värdena för de retentionstider som erhållits för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 i extraherade avloppsvattenprover, var ≤ 0,62 %. RSD-värdena för toppområdena för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 i de extraherade avloppsvattenproverna var ≤ 7,8 % (”The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems”). Dessutom var linjäriteten, uttryckt som korrelationskoefficienten (R2) för kalibreringskurvorna i de behandlade avloppsvattenproverna, 0,988 och 0,957 för diazepam respektive nordiazepam.

Ingen carryover i LC-MS/MS-systemet observerades i den här studien, eftersom inga toppar av analyterna eller de isotopmärkta föreningarna påvisades i något av de injicerade renade Millipore-vattenproverna. Det fanns inga tecken på att någon korskontaminering skulle ha skett under provhanteringen eller extraktionen i fast fas eftersom de extraherade fosfatbuffertproverna inte innehöll några av målföreningarna. Risken för att få falskt positiva resultat till följd av självkontaminering ansågs därför ha minimerats i denna studie.

LOQ och LOD för diazepam-d5 och nordiazepam-d5 bestämdes i behandlade avloppsvattenprover. Kvantifieringsgränserna sattes till 5,0 pM (1,4 ng L-1) för både diazepam-d5 och nordiazepam-d5 där signal-brusförhållandet var cirka 10 och den erhållna precisionen var 12,7 och 15,9 RSD % (n = 3) för respektive förening (tabell 3), dvs. inom den stipulerade precisionen på 20 % . De erhållna LOQ-värdena i den aktuella studien ligger inom det område som har uppnåtts i andra studier för diazepam och nordiazepam i behandlade avloppsvattenprover . I den studien extraherades dock en volym på 200 mL behandlat avloppsvatten, jämfört med 75 mL i vår metod. Detektionsgränserna var 1,7 pM (0,49 ng L-1) och 2,0 pM (0,55 ng L-1) för diazepam-d5 respektive nordiazepam-d5 (tabell 3).

Som diskuterats ovan (”Stabiliteten hos diazepam och nordiazepam i sura och neutrala vattenprover”, fig. 2) visade sig diazepam och nordiazepam vara stabila i 12 dagar vid pH 7 i provet.0 när de förvarades i rumstemperatur eller vid 4 °C.

Kvantifiering av diazepam och nordiazepam i miljövattenprover

Den utvecklade LC-MS/MS-metoden tillämpades på miljövattenprover för bestämning av diazepam och nordiazepam. Det måste betonas att den utvecklade metoden kan användas för bestämning av diazepam och nordiazepam i miljöprover i sura förhållanden om idealiska interna standarder tillsätts till proverna före lagring, dvs. isotopmärkta föreningar av målföreningarna. I denna studie användes de isotopmärkta föreningarna, diazepam-d5 och nordiazepam-d5, som interna standarder för att kompensera för föreningarnas potentiella omvandling och andra förluster samt variationer under analysen.

Behandlade avloppsvatten- och ytvattenprover analyserades med avseende på diazepam och nordiazepam. Det fanns inga signifikanta skillnader, på 5 %-nivån i ett t-test, mellan de jonförhållanden som erhölls för standardlösningar (tabell 1) och de som erhölls för ”naturligt” förekommande diazepam eller nordiazepam (P ≥ 0,07). Koncentrationerna av diazepam och nordiazepam bestämdes till 8,5 (2,4 ng L-1) respektive 66 pM (18 ng L-1). I prover från samma reningsverk som samlades in 14 dagar senare bestämdes koncentrationerna till 7,5 (2,1 ng L-1) och 75 pM (20 ng L-1) för diazepam respektive nordiazepam. Koncentrationerna av nordiazepam var alltså ungefär en storleksordning högre än koncentrationerna av diazepam. Dessa resultat stämmer överens med resultat från andra studier av avloppsvatten . I vissa behandlade avloppsvattenprover som rapporterats i litteraturen kvantifierades dessutom nordiazepam, men diazepam påvisades inte . I denna studie påvisades varken diazepam eller nordiazepam i ytvatten från Fyrisälven, 3 km uppströms från reningsverket Kungsängsverket, vilket tyder på att det finns få antropogena utsläpp av avloppsvatten uppströms.