Tandem masspektrometri

Fragmentering av joner i gasfas är nödvändig för tandem-masspektrometri och sker mellan olika steg i massanalysen. Det finns många metoder som används för att fragmentera jonerna och dessa kan resultera i olika typer av fragmentering och därmed olika information om molekylens struktur och sammansättning.

Fragmentering i källanEdit

Ofta är joniseringsprocessen tillräckligt våldsam för att de resulterande jonerna ska ha tillräckligt med inre energi för att kunna fragmenteras i masspektrometern. Om produktjonerna kvarstår i sitt icke-jämviktstillstånd under en måttlig tid före auto-dissociation kallas denna process för metastabil fragmentering. Med fragmentering genom munstycke-skimmer avses den avsiktliga induktionen av fragmentering i källan genom att öka potentialen i munstycke-skimmern på instrument som vanligen är baserade på elektrospray. Även om in-source-fragmentering möjliggör fragmenteringsanalys är det tekniskt sett inte tandem-masspektrometri om inte metastabila joner massanalyseras eller väljs ut före auto-dissociation och ett andra analyssteg utförs på de resulterande fragmenten. In-source-fragmentering kan användas i stället för tandem-masspektrometri genom användning av EISA-teknik (Enhanced in-Source Fragmentation Annotation) som genererar fragmentering som direkt matchar tandem-masspektrometridata. Fragment som observeras av EISA har högre signalintensitet än traditionella fragment som går förlorade i kollisionscellerna i tandem-masspektrometrar. EISA gör det möjligt att samla in fragmenteringsdata på MS1 massanalysatorer, t.ex. time-of-flight- och single quadrupol-instrument. In-source-fragmentering används ofta tillsammans med tandem-masspektrometri (med post-source-fragmentering) för att möjliggöra fragmentering i två steg i ett experiment av pseudo-MS3-typ.

Kollisionsinducerad dissociationRedigera

Post-source-fragmentering är oftast det som används i ett experiment med tandem-masspektrometri. Energi kan också tillföras jonerna, som vanligtvis redan är vibrerande exciterade, genom kollisioner efter källan med neutrala atomer eller molekyler, absorption av strålning eller överföring eller infångning av en elektron av en flerfaldigt laddad jon. Kollisionsinducerad dissociation (CID), även kallad kollisionsaktiverad dissociation (CAD), innebär att en jon kolliderar med en neutral atom eller molekyl i gasfasen och därefter dissocieras av jonen. Tänk till exempel på

AB + + M ⟶ A + B + + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}}

där jonen AB+ kolliderar med den neutrala arten M och därefter bryts isär. Detaljerna i denna process beskrivs av kollisionsteorin. På grund av olika instrumentkonfigurationer är två olika typer av CID möjliga: (i) stråltyp (där prekursorjoner fragmenteras under flygningen) och (ii) jonfälla-typ (där prekursorjoner först fångas in och sedan fragmenteras).

En tredje och nyare typ av CID-fragmentering är kollisionell dissociation med högre energi (HCD). HCD är en CID-teknik som är specifik för orbitrap-masspektrometrar där fragmenteringen sker utanför jonfällan, den sker i HCD-cellen (i vissa instrument kallad ”ion routing multipole”). HCD är en fragmentering av fångtyp som har visat sig ha egenskaper av stråltyp. Det finns fritt tillgängliga storskaliga databaser för högupplöst tandem-masspektrometri (t.ex. METLIN med 850 000 molekylära standarder, var och en med experimentella CID MS/MS-data), och de används vanligen för att underlätta identifiering av små molekyler.

Metoder för infångning och överföring av elektronerRedigera

Den energi som frigörs när en elektron överförs till eller infångas av en flerfaldigt laddad jon kan framkalla fragmentering.

Dissociation genom infångning av elektronerRedigera

Om en elektron läggs till en flerfaldigt laddad positiv jon frigörs Coulombenergin. Att lägga till en fri elektron kallas för electron-capture dissociation (ECD) och representeras av

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragment {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragment}}}}

för en multipelt protonerad molekyl M.

ElektronöverföringsdissociationRedigera

Att lägga till en elektron genom en jon-jonreaktion kallas för elektronöverföringsdissociation (ETD). I likhet med elektroninfångningsdissociation inducerar ETD fragmentering av katjoner (t.ex. peptider eller proteiner) genom att överföra elektroner till dem. Den uppfanns av Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka och Jarrod Marto vid University of Virginia.

ETD använder inte fria elektroner utan använder radikala anjoner (t.ex. antracen eller azobensen) för detta ändamål:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragment {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}}}

där A är anjonen.

ETD klyver slumpmässigt längs peptidryggraden (c- och z-joner), medan sidokedjor och modifieringar, som fosforylering, lämnas intakta. Tekniken fungerar endast bra för joner med högre laddningstillstånd (z>2), men i förhållande till kollisionsinducerad dissociation (CID) är ETD fördelaktigt för fragmentering av längre peptider eller till och med hela proteiner. Detta gör tekniken viktig för top-down proteomik. I likhet med ECD är ETD effektivt för peptider med modifieringar såsom fosforylering.

Elektronöverföring och kollisionsdissociation med högre energi (EThcD) är en kombination av ETD och HCD där peptidprekursorn inledningsvis utsätts för en jon/jonreaktion med fluorantenanjoner i en linjär jonfälla, vilket genererar c- och z-joner. I det andra steget tillämpas HCD-fragmentering av alla joner som härrör från ETD för att generera b- och y-joner före den slutliga analysen i orbitrap-analysatorn. Denna metod använder dubbel fragmentering för att generera jon- och därmed datarika MS/MS-spektra för peptidsekvensering och PTM-lokalisering.

Negativ elektronöverföringsdissociationRedigera

Fragmentering kan också inträffa med en deprotonerad art, där en elektron överförs från arten till en katjonisk reagens i en negativ elektronöverföringsdissociation (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragment {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragment}}}

Följande denna överföringshändelse genomgår den elektronbristande anjonen en intern omgruppering och fragmenteras. NETD är en jon/jon-analog till elektronavskiljande dissociation (EDD).

NETD är kompatibel med fragmentering av peptider och proteiner längs ryggraden vid Cα-C-bindningen. De resulterande fragmenten är vanligen produktjoner av a– och x-typ.

ElektronavskiljningsdissociationEdit

Elektronavskiljningsdissociation (EDD) är en metod för fragmentering av anjoniska arter vid masspektrometri. Den fungerar som ett negativt motläge till elektronfångstdissociation. Negativt laddade joner aktiveras genom bestrålning med elektroner med måttlig kinetisk energi. Resultatet är att elektroner kastas ut från den joniska modermolekylen, vilket orsakar dissociation genom rekombination.

LaddningsöverföringsdissociationEdit

Reaktionen mellan positivt laddade peptider och katjoniska reagens, även känd som laddningsöverföringsdissociation (CTD), har nyligen demonstrerats som en alternativ högenergifragmenteringsväg för peptider med lågt laddningstillstånd (1+ eller 2+). Den föreslagna mekanismen för CTD med heliumkatjoner som reagens är:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragment {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}\left^{2}+}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragment}}}

De första rapporterna visar att CTD orsakar klyvning av Cα-C-bindningar i ryggraden av peptider och ger produktjoner av a– och x-typ.

FotodissociationEdit

Den energi som krävs för dissociation kan läggas till genom fotonabsorption, vilket resulterar i jonfotodissociation och representeras av

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}}

varvid h ν {\displaystyle h\nu }

representerar den foton som absorberas av jonen. Ultravioletta lasrar kan användas, men kan leda till överdriven fragmentering av biomolekyler.

Infraröd multifotondissociationRedigera

Infraröda fotoner kommer att värma jonerna och orsaka dissociation om tillräckligt många av dem absorberas. Denna process kallas infraröd multifotondissociation (IRMPD) och utförs ofta med en koldioxidlaser och en jonfångande masspektrometer, t.ex. en FTMS.

Blackbody infrared radiative dissociationEdit

Blackbody-strålning kan användas för fotodissociation i en teknik som kallas blackbody infrared radiative dissociation (BIRD). I BIRD-metoden värms hela masspektrometerns vakuumkammare upp för att skapa infrarött ljus. BIRD använder denna strålning för att excitera allt mer energirika vibrationer hos jonerna, tills en bindning bryts och fragment bildas. Detta liknar infraröd multifotondissociation som också använder infrarött ljus, men från en annan källa. BIRD används oftast med Fouriertransform joncyklotronresonansmasspektrometri.

Ytinducerad dissociationRedigera

Med ytinducerad dissociation (SID) är fragmenteringen ett resultat av att en jon kolliderar med en yta under högt vakuum. Idag används SID för att fragmentera ett brett spektrum av joner. För flera år sedan var det bara vanligt att använda SID på lågmassiga, enkelt laddade arter eftersom joniseringsmetoder och massanalysatortekniker inte var tillräckligt avancerade för att korrekt bilda, överföra eller karakterisera joner med hög m/z. Med tiden har självmonterade monolagsytor (SAM) bestående av CF3(CF2)10CH2CH2S på guld varit de mest framträdande kollisionsytorna för SID i en tandemspektrometer. SAMs har fungerat som de mest önskvärda kollisionsmålen på grund av deras karakteristiska stora effektiva massor för kollision av inkommande joner. Dessutom består dessa ytor av styva fluorkarbonkedjor som inte dämpar projektiljonernas energi nämnvärt. Fluorkarbonkedjorna är också fördelaktiga på grund av sin förmåga att motstå en enkel elektronöverföring från metallytan till de inkommande jonerna. SID:s förmåga att producera subkomplex som förblir stabila och ger värdefull information om konnektivitet är oöverträffad av någon annan dissociationsteknik. Eftersom de komplex som produceras med SID är stabila och behåller laddningsfördelningen på fragmentet, ger detta ett unikt spektrum där komplexet är centrerat kring en smalare m/z-fördelning. SID-produkterna och den energi vid vilken de bildas återspeglar komplexets styrka och topologi. De unika dissociationsmönstren hjälper till att upptäcka komplexets kvartära struktur. Den symmetriska laddningsfördelningen och dissociationsberoendet är unika för SID och gör att de spektrum som produceras skiljer sig från alla andra dissociationstekniker.

SID-tekniken är också tillämpbar på masspektrometri med jonmobilitet (IM-MS). Tre olika metoder för den här tekniken omfattar analys av karakterisering av topologi, intersubunitkonnektivitet och graden av utvikning för proteinstruktur. Analys av proteinstrukturens avveckling är den vanligaste tillämpningen av SID-tekniken. För jonmobilitetsmasspektrometri (IM-MS) används SID för dissociation av de källaktiverade prekursorerna av tre olika typer av proteinkomplex: C-reaktivt protein (CRP), transthyretin (TTR) och concanavalin A (Con A). Denna metod används för att observera utvikningsgraden för vart och ett av dessa komplex. För denna observation visade SID de strukturer hos prekursorjonerna som existerar före kollisionen med ytan. IM-MS använder SID som ett direkt mått på konformationen för varje proteins underenhet.

Fourier-transform joncyklotronresonans (FTICR) kan ge ultrahög upplösning och hög massnoggrannhet till instrument som utför massmätningar. Dessa egenskaper gör FTICR-masspektrometrar till ett användbart verktyg för en mängd olika tillämpningar, t.ex. flera dissociationsexperiment som kollisionsinducerad dissociation (CID), elektronöverföringsdissociation (ETD) och andra. Dessutom har ytinducerad dissociation genomförts med detta instrument för att studera grundläggande peptidfragmentering. SID har särskilt tillämpats för att studera energetik och kinetik för fragmentering i gasfas i ett ICR-instrument. Detta tillvägagångssätt har använts för att förstå gasfasfragmenteringen av protonerade peptider, peptidjoner med udda elektroner, icke-kovalenta ligand-peptidkomplex och ligerade metallkluster.