Abstract
Glykogenfosforylas är ett viktigt enzym för kolhydratmetabolismen i muskler. Det använder oorganisk fosfat för att avlägsna glukos från glykogen och producerar glukos-1-fosfat, som kan användas för produktion av ATP. Inaktivt glykogenfosforylas (fosforylas h) aktiveras antingen genom allosterisk bindning av 5′-AMP eller genom fosforylering av fosforylaskinas (PhK). Fosforylering ger upphov till fosforylas a, som är aktivt i avsaknad av AMP. PhK är det enda kinas som kan fosforylera fosforylas b, som i sin tur är det enda substratet för PhK. I denna avhandlingsforskning har man försökt fastställa orsakerna till denna specificitet och hur dessa två enzymer känner igen varandra genom att studera platsstyrda mutanter av glykogenfosforylas;Alla mutanter undersöktes för förändringar i deras interaktion med en trunkerad form av den katalytiska underenheten av fosforylaskinas, gamma(1–300). Tre mutationer (R69K, R69E och E501A), gjorda på platser som interagerar med aminoterminus i antingen fosforylas b eller a, visade liten skillnad i fosforylering av gamma(1–300) jämfört med fosforylas b. Fem mutationer, gjorda på tre platser i fosforylasets aminoterminala svans (K11A, K11E, I13G, R16A och R16E), gav dock minskad katalytisk effektivitet för gamma(1–300) jämfört med fosforylas b. R16E var det sämsta substratet för gamma(1–300) och gav en 47-faldig minskning av den katalytiska effektiviteten. Aminoterminen, och särskilt Arg 16, är mycket viktiga faktorer för att gamma(1–300) ska känna igen fosforylaset. Dessutom kunde I13G och R16A fosforyleras av proteinkinas A, som inte känner igen nativt fosforylas;Några av mutanterna observerades också ha förändrade konformationstillstånd. R16A och R16E aktiverades vid mycket låg AMP-koncentration och kristalliserades vid låg temperatur, som fosforylas a. Detta tyder på att även utan fosforylering är deras strukturer mer lika fosforylas a än fosforylas b. Två andra mutanter gav den motsatta effekten, och uppförde sig som fosforylas b efter fosforylering. R69E aktiverades endast delvis av fosforylering och I13G var helt inaktiv efter fosforylering. I13G var den första observationen av en fosforylasform som inte kunde aktiveras genom fosforylering.