H-D-utbyte mättes ursprungligen av vätgasutbytets fader Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang med hjälp av densitetsgradientrör. I modern tid har H-D-utbytet främst övervakats med metoderna: NMR-spektroskopi, masspektrometri och neutronkristallografi. Var och en av dessa metoder har sina för- och nackdelar.
NMR-spektroskopiRedigera
Hydrogen- och deuteriumkärnor skiljer sig grovt åt i sina magnetiska egenskaper. Därför är det möjligt att skilja dem åt med hjälp av NMR-spektroskopi. Deuteroner kommer inte att observeras i ett 1H NMR-spektrum och omvänt kommer protoner inte att observeras i ett 2H NMR-spektrum. När små signaler observeras i ett 1H-NMR-spektrum av ett högt deuterat prov kallas dessa för restsignaler. De kan användas för att beräkna deutereringsnivån i en molekyl. Analoga signaler observeras inte i 2H NMR-spektra på grund av den låga känsligheten hos denna teknik jämfört med 1H-analysen. Deuteroner uppvisar vanligtvis mycket liknande kemiska skift som deras analoga protoner. Analys via 13C NMR-spektroskopi är också möjlig: de olika spinnvärdena för väte (1/2) och deuterium (1) ger upphov till olika splittringsmultiplikatorer. NMR-spektroskopi kan användas för att bestämma platsspecifik deuterering av molekyler.
En annan metod använder HSQC-spektra. Typiskt sett registreras HSQC-spektra vid en rad tidpunkter medan väte utbyts mot deuterium. Eftersom HSQC-experimentet är specifikt för väte kommer signalen att avta exponentiellt när väte utbyts. Det är då möjligt att anpassa en exponentialfunktion till data och få fram utbyteskonstanten. Denna metod ger restspecifik information för alla rester i proteinet samtidigt Den största nackdelen är att den kräver en tidigare tilldelning av spektrumet för proteinet i fråga. Detta kan vara mycket arbetsintensivt och begränsar vanligen metoden till proteiner som är mindre än 25 kDa. Eftersom det tar minuter till timmar att spela in ett HSQC-spektrum måste amider som byts ut snabbt mätas med andra pulssekvenser.
MasspektrometriRedigera
Hydrogen-deuteriumutbytesmasspektrometri kan bestämma det totala deuteriuminnehållet i molekyler som har genomgått H/D-utbyte. På grund av den provberedning som krävs anses det vanligtvis ge en noggrann mätning endast av icke utbytbara väteatomer. Det kan också innebära H/D-utbyte i gasfas eller utbyte i lösningsfas före jonisering. Det har flera fördelar i NMR-spektroskopi när det gäller analys av H/D-utbytesreaktioner: mycket mindre material behövs, koncentrationen av provet kan vara mycket låg (så låg som 0,1 uM), storleksgränsen är mycket större och data kan vanligen samlas in och tolkas mycket snabbare.
Deuteriumkärnan är dubbelt så tung som vätgaskärnan eftersom den innehåller både en neutron och en proton. En molekyl som innehåller en del deuterium blir alltså tyngre än en molekyl som bara innehåller väte. När ett protein blir allt mer deuterat ökar molekylmassan i motsvarande grad. Att upptäcka förändringen i ett proteins massa vid deuterering möjliggjordes genom modern proteinmasspektrometri, som först rapporterades 1991 av Katta och Chait.
Det är mer komplicerat att bestämma platsspecifik deuterering via masspektrometri än att använda NMR-spektroskopi. Till exempel kan platsen och den relativa mängden deuteriumutbyte längs peptidryggen bestämmas grovt genom att proteinet utsätts för proteolys efter att utbytesreaktionen har släckts. Enskilda peptider analyseras sedan med avseende på den totala deutereringen av varje peptidfragment. Med denna teknik bestäms upplösningen av deuteriumutbytet av storleken på de peptider som produceras under nedbrytningen. Pepsin, ett surt proteas, används vanligen för proteolys, eftersom pH-värdet måste bibehållas under den proteolytiska reaktionen. För att minimera backutbytet måste proteolysen och den efterföljande masspektrometrianalysen ske så snabbt som möjligt. HPLC-separation av det peptiska digesten utförs ofta vid låg temperatur strax före elektrospray-masspektrometri för att minimera återutbytet. På senare tid har UPLC använts på grund av dess överlägsna separationsförmåga.
Det föreslogs 1999 att det skulle kunna vara möjligt att uppnå upplösning av en enda residual genom att använda kollisionsinducerad dissociation (CID) fragmentering av deutererade peptider i samband med tandem-masspektrometri. Det upptäcktes snart att CID orsakar ”scrambling” av deuteriumpositionen i peptiderna. Fragmentering som produceras av MALDI-in-source decay (ISD), elektroninfångningsdissociation (ECD) och elektronöverföringsdissociation (ETD) sker dock med liten eller ingen scrambling under korrekta experimentella förhållanden. Förvirring av isotopmärkningen orsakas av kollisionsuppvärmning före jonens dissociation, och även om CID orsakar förvirring kan kollisionsuppvärmning också inträffa under jonisering och jontransport. Genom noggrann optimering av de instrumentparametrar som orsakar jonuppvärmning kan dock väteförvirringen minimeras till en grad som bevarar isotopmärkningen i lösningsfasen tills fragmentering kan utföras med hjälp av en teknik där förvirring inte förekommer. På senare tid har ultraviolett fotodissociation (UVPD) också undersökts som en möjlig fragmenteringsteknik för att lokalisera deuterium i peptider och proteiner. Slutsatserna i detta avseende har varit blandade, medan det är möjligt att erhålla UVPD-fragment som inte har genomgått scrambling under vissa förhållanden, har andra visat att scrambling kan inträffa för både peptider och proteiner under själva UVPD-fragmenteringssteget. Den nuvarande teorin som konsoliderar dessa uppenbara motsägelser har att göra med den dubbla fragmenteringsväg som kan uppstå vid UV-strålning av peptider och proteiner, dvs. direkt och statistisk dissociation. Om de experimentella förhållandena gynnar direkt dissociation och prekursorjonen hålls vid låga interna energier före och under fragmenteringen kommer deuteriumnivån i de resulterande fragmenten att motsvara den icke-skramlade prekursorn. Experimentella förhållanden kan dock gynna statistisk dissociation under UV-strålning, särskilt vid långa strålningstider och lågt gastryck, vilket leder till intern omvandling av den elektroniska excitationsenergi som UV-fotonerna bidrar med. Resultatet är vibrationell excitation av den bestrålade molekylen som i sin tur genomgår scrambling.
NeutronkristallografiRedigera
Hydrogen-deuteriumutbyte av snabbväxlande arter (t.ex. hydroxylgrupper) kan mätas kvantitativt med atomär upplösning genom neutronkristallografi, och i realtid om utbytet sker under diffraktionsexperimentet.
Nutronstrålar med hög intensitet genereras vanligen genom spallation vid linac-partikelacceleratorer, såsom Spallation Neutron Source. Neutroner diffrakterar kristaller på samma sätt som röntgenstrålar och kan användas för strukturbestämning. Väteatomer, med mellan en och noll elektroner i en biologisk miljö, diffrakterar röntgenstrålar dåligt och är i praktiken osynliga under normala experimentella förhållanden. Neutroner sprids från atomkärnor och kan därför upptäcka väte- och deuteriumatomer.
Väteatomer ersätts rutinmässigt med deuterium, vilket introducerar en stark och positiv spridningsfaktor. Det räcker ofta att ersätta endast lösningsmedlet och de labila väteatomerna i en proteinkristall genom ångdiffusion. I en sådan struktur kommer ockupationen av en utbytbar deuteriumatom i en kristall att förfinas från 0-100 %, vilket direkt kvantifierar mängden utbyte.