V(D)J-rekombination

Nyckelenzymer och komponenterRedigera

V(D)J-rekombinationsprocessen förmedlas av VDJ-rekombinas, som är en samling olika enzymer. De viktigaste enzymerna som är involverade är rekombinationsaktiverande gener 1 och 2 (RAG), terminal deoxynukleotidyltransferas (TdT) och Artemis-nukleas, en medlem av den allestädes närvarande icke-homologous end joining (NHEJ)-vägen för DNA-reparation. Flera andra enzymer är kända för att vara involverade i processen och inkluderar DNA-beroende proteinkinas (DNA-PK), X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), DNA-ligas IV, non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; även känd som Cernunnos eller XRCC4-liknande faktor ), den nyligen upptäckta paralogen av XRCC4 och XLF (PAXX), och DNA-polymeraserna λ och μ. Vissa inblandade enzymer är specifika för lymfocyter (t.ex. RAG, TdT), medan andra finns i andra celltyper och till och med ubiquitärt (t.ex. NHEJ-komponenter).

För att bibehålla rekombinationens specificitet känner V(D)J-rekombinaset igen och binder sig till rekombinationssignalssekvenser (RSS) som flankerar segmenten för de variabla (V), mångfaldiga (D) och sammanfogande (J) generna. RSS består av tre element: en heptamer med sju bevarade nukleotider, en spacerregion med en längd på 12 eller 23 baspar och en nonamer med nio bevarade nukleotider. Även om majoriteten av RSS:erna varierar i sekvens, är konsensussekvenserna för heptamer och nonamer CACAGTG respektive ACAAAAACC, och även om sekvensen för spacerregionen är dåligt bevarad är längden mycket bevarad. Längden på spacerregionen motsvarar ungefär en (12 baspar) eller två varv (23 baspar) av DNA-helixen. Enligt den s.k. 12/23-regeln gränsar de gensegment som skall rekombineras vanligen till RSS med olika spacerlängder (dvs. en har en ”12RSS” och en har en ”23RSS”). Detta är ett viktigt inslag i regleringen av V(D)J-rekombination.

ProcessEdit

V(D)J-rekombination börjar när V(D)J-rekombinas (genom RAG1:s aktivitet) binder till en RSS som flankerar ett kodande gensegment (V, D eller J) och skapar en singelsträngsnick i DNA:t mellan den första basen i RSS:t (strax före heptameren) och det kodande segmentet. Detta är i huvudsak energimässigt neutralt (inget behov av ATP-hydrolys) och resulterar i bildandet av en fri 3′-hydroxylgrupp och en 5′-fosfatgrupp på samma sträng. Den reaktiva hydroxylgruppen placeras av rekombinaset så att den angriper fosfodiesterbindningen i den motsatta strängen och bildar två DNA-ändar: en hårnål (stam-slinga) på kodningssegmentet och en trubbig ände på signalsegmentet. Den nuvarande modellen är att DNA-nickning och hårnålsbildning sker på båda strängarna samtidigt (eller nästan) i ett komplex som kallas rekombinationscentrum.

De trubbiga signaländarna spolas ihop för att bilda ett cirkulärt stycke DNA som innehåller alla de mellanliggande sekvenserna mellan kodningssegmenten och som kallas signalled (även om det är cirkulärt till sin natur ska detta inte förväxlas med en plasmid). Även om man ursprungligen trodde att de försvann under successiva celldelningar finns det bevis för att signalförbindelserna kan återinträda i genomet och leda till patologier genom att aktivera onkogener eller avbryta tumörsuppressorgenens funktion(er).

De kodande ändarna bearbetas ytterligare innan de ligeras genom flera händelser som i slutändan leder till junctional mångfald. Bearbetningen börjar när DNA-PK binder till varje bruten DNA-änd och rekryterar flera andra proteiner, däribland Artemis, XRCC4, DNA-ligas IV, Cernunnos och flera DNA-polymeraser. DNA-PK bildar ett komplex som leder till dess autofosforylering, vilket resulterar i aktivering av Artemis. De kodande hårnålarna öppnas av Artemis aktivitet. Om de öppnas i mitten blir resultatet en trubbig DNA-ända, men i många fall sker öppningen ”utanför mitten” och resulterar i att extra baser blir kvar på den ena strängen (ett överhäng). Dessa är kända som palindromiska (P) nukleotider på grund av den palindromiska karaktären hos den sekvens som bildas när DNA-reparationsenzymerna löser upp överhänget. Processen med hårnålsöppning av Artemis är ett avgörande steg i V(D)J-rekombinationen och är defekt i musmodellen för svår kombinerad immunbrist (scid).

Nästan anpassar XRCC4, Cernunnos och DNA-PK DNA-ändarna och rekryterar terminal deoxynukleotidyltransferas (TdT), ett malloberoende DNA-polymeras som lägger till icke-templaterade (N) nukleotider till den kodande ändan. Tillägget är mestadels slumpmässigt, men TdT uppvisar en preferens för G/C-nukleotider. Liksom alla kända DNA-polymeraser lägger TdT till nukleotider till en sträng i en 5′- till 3′-riktning.

Sist kan exonukleaser avlägsna baser från de kodande ändarna (inklusive eventuella P- eller N-nukleotider som kan ha bildats). DNA-polymeraserna λ och μ infogar sedan ytterligare nukleotider vid behov för att göra de två ändarna kompatibla för sammanfogning. Detta är en stokastisk process, därför kan alla kombinationer av tillägg av P- och N-nukleotider och exonukleolytisk borttagning förekomma (eller ingen alls). Slutligen ligeras de bearbetade kodande ändarna samman av DNA-ligas IV.

Alla dessa bearbetningshändelser resulterar i en paratop som är mycket variabel, även när samma gensegment rekombineras. V(D)J-rekombination möjliggör generering av immunglobuliner och T-cellsreceptorer mot antigener som varken organismen eller dess förfader(er) behöver ha stött på tidigare, vilket möjliggör ett adaptivt immunsvar mot nya patogener som utvecklas eller mot patogener som ofta förändras (t.ex. säsongsinfluensa). En viktig invändning mot denna process är dock att DNA-sekvensen måste förbli inramad för att bibehålla den korrekta aminosyrasekvensen i den slutliga proteinprodukten. Om den resulterande sekvensen inte är i rätt ordning kommer cellens utveckling att stoppas och cellen kommer inte att överleva till mognad. V(D)J-rekombination är därför en mycket kostsam process som måste vara (och är) strängt reglerad och kontrollerad.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.