Testul clonogenic: ce, de ce și cum

Un test clonogenic, cunoscut și sub numele de test de formare a coloniilor

este un test de supraviețuire celulară in vitro. Acesta evaluează capacitatea celulelor individuale de a supraviețui și de a se reproduce pentru a forma colonii.1 Acest test a fost descris pentru prima dată în anii 1950, unde a fost folosit pentru a studia efectele radiațiilor asupra supraviețuirii și creșterii celulelor canceroase și a jucat ulterior un rol esențial în radiobiologie.2

Pentru a măsura clonogenitatea, celulele trebuie să fie însămânțate la densități foarte mici și lăsate pentru o perioadă de 1-3 săptămâni pentru a se forma colonii. Coloniile sunt apoi fixate, colorate cu cristal violet pentru a le face vizibile și numărate. Pentru a analiza datele, se trasează curbele de supraviețuire a celulelor. Astăzi, testele clonogenice sunt folosite pentru a răspunde la o varietate de întrebări experimentale, în special în biologia cancerului.

Acest blog evidențiază:

Cum se realizează un test clonogenic, cu considerații importante care trebuie făcute pe parcurs

Utilizarea microscopiei fără etichete și a detectării confluenței pentru a evalua numărul și dimensiunea coloniilor folosind cuantificarea automată a imaginilor

Testul de supraviețuire clonogenică

Testele clonogenice sunt utilizate pe scară largă în domeniul cercetării cancerului, deoarece formarea de clone este interpretată ca o trăsătură a celulelor canceroase cu capacități de inițiere a tumorii. Deși acest test a fost utilizat inițial în domeniul radiobiologiei, a devenit un instrument standard în cercetarea cancerului pentru a evalua creșterea celulară și efectele citotoxice sau genotoxice ale diverșilor agenți cu potențiale aplicații clinice. Aceasta include agenții chimioterapeutici și terapiile țintite, singure sau în combinație. 3.

Creșterea clonogenică este, de asemenea, utilizată pentru a evalua caracterul stem al anumitor populații celulare, deoarece celulele stem sunt celule cu durată de viață lungă, cu potențial de proliferare continuă. Acest lucru este deosebit de relevant pentru cercetarea în domeniul cancerului, deoarece celulele stem canceroase sunt adesea asociate cu chimiorezistența, formarea de tumori secundare și recidiva cancerului. Prin urmare, investigarea stenozității cancerului cu ajutorul unui test clonogenic este un instrument valoros și utilizat pe scară largă pentru a prezice eficacitatea unei anumite terapii.4

Sajele clonogenice măsoară capacitatea celulelor de a-și păstra integritatea reproductivă pe o perioadă de timp prelungită. Aceasta este o caracteristică importantă, deoarece dezvăluie efecte fenotipice care necesită timp și, eventual, mai multe diviziuni celulare pentru a se dezvolta. Atunci când se analizează rezistența terapeutică, acest lucru este deosebit de important. Rezistența la medicamente nu poate fi identificată cu ajutorul testelor de citotoxicitate pe termen scurt.5

Cum se efectuează un test clonogenic

Informațiile din această secțiune sunt adaptate de la Franken et al. (2006), care au publicat un protocol de testare clonogenică în Nature Protocols1, combinate cu unele informații din propria mea experiență dobândită în urma efectuării a peste 60 de teste clonogenice în timpul doctoratului meu.

În esență, există două moduri diferite de a efectua un test clonogenic:

(1) Celulele pot fi însămânțate la densități mici și apoi tratate pentru a examina efectul tratamentului asupra clonogenicității celulelor.

(2) Celulele pot fi tratate pentru o perioadă specificată și apoi repopulate la densități mici în medii fără tratament pentru a testa capacitatea clonogenică.

Aceasta din urmă este adesea utilizată pentru a evalua rezistența terapeutică după tratament. Figura 1 rezumă prima abordare, care este metoda tradițională de efectuare a unui test clonogenic. După cum va deveni clar, aceasta este o metodă care consumă mult timp și care nu oferă informații privind evoluția experimentului (doar punctul final). Vom discuta mai târziu metodele alternative automatizate și non-endpoint.

Protocol tradițional pentru teste clonogenice

Figura. 1 | Un rezumat al unui protocol clonogenic tradițional în care celulele sunt însămânțate, tratate și apoi se evaluează clonogenitatea.

Sajele clonogenice se efectuează de obicei în plăci cu 6 sau 24 de puțuri. Celulele trebuie să fie placate în mod rar și uniform, astfel încât să se poată forma colonii izolate. Prin urmare, este important să optimizați densitatea de însămânțare pentru dimensiunea aleasă a godeurilor înainte de a efectua testul clonogenic.

Un bun punct de plecare este să căutați în literatura de specialitate pentru a vedea dacă există studii care au efectuat teste clonogene cu linia dvs. celulară și apoi să testați această densitate de însămânțare și alte două sau trei. În timpul acestui proces de optimizare, este, de asemenea, important să luați în considerare punctul final al experimentului (de exemplu, 7 zile, 14 zile sau 21 de zile) și rata de creștere celulară, deoarece nu doriți colonii care fuzionează, ceea ce va interfera cu cuantificarea și analiza coloniilor. Densitățile de însămânțare trebuie să fie aceleași pentru toate condițiile de tratament din cadrul experimentului dumneavoastră.
Utilizarea controalelor corecte este esențială pentru etapa de analiză. Ar trebui să se utilizeze întotdeauna un control netratat, precum și un control numai cu vehicul (acesta ar putea fi DMSO, PBS sau orice solvent în care este dizolvat tratamentul dumneavoastră). Pentru condițiile de tratament, se utilizează adesea o serie de diluții. Perioada de tratament și duritatea tratamentului vă vor ajuta să determinați intervalul de concentrație – este posibil ca acest lucru să necesite o anumită optimizare. Fiecare condiție de control și experimentală trebuie efectuată în triplu exemplar.

În timpul fazei de formare a coloniilor, va trebui să monitorizați creșterea coloniilor în toate condițiile de tratament. O colonie este considerată a fi de 50 de celule sau mai mult și acestea sunt vizibile doar la microscop. Deoarece acest test se desfășoară de obicei pe o perioadă lungă de timp, va trebui să schimbați mediul celular. La început, celulele vor fi la o confluență foarte scăzută, astfel încât nu va fi nevoie să schimbați mediile la fel de regulat ca în mod normal. Cu toate acestea, dacă semănați și apoi tratați cu un medicament sau un compus, este important să luați în considerare timpul de înjumătățire al acestuia și să adăugați un nou tratament după cum este necesar.

Pentru cercetătorii care sunt interesați să obțină imagini ale creșterii coloniei în timp. Vă recomandăm să vă uitați la CytoSMART Omni.

—————–

De multe ori, coloniile aflate în condiții de control sunt cele care cresc cel mai rapid și, prin urmare, puteți folosi aceste celule ca o indicație a punctului final al experimentului, adică încheiați experimentul înainte ca coloniile să înceapă să se unească și, dacă acest lucru se întâmplă prea repede, utilizați mai degrabă o densitate de însămânțare mai mică pentru experimentul dumneavoastră. Este important să încheiați experimentul pentru toate condițiile de tratament în același timp.

După ce ați atins punctul final al experimentului, celulele trebuie spălate ușor cu PBS (adăugați PBS pe partea laterală a godeului pentru a nu perturba coloniile), fixate și colorate cu colorantul de intercalare a ADN-ului, cristal violet (0,5% p/v) timp de cel puțin 30 de minute. Îndepărtarea excesului de colorant poate fi murdară. Cea mai bună tehnică este să scufundați ușor plăcile în pahare cufundate în apă până când tot excesul de colorant a fost îndepărtat și ați rămas doar cu colonii de culoare purpurie strălucitoare. Coloniile colorate pot fi numărate până la 50 de săptămâni după colorare. Faceți fotografii de înaltă rezoluție ale godeurilor dvs. pentru a le folosi pentru analize, prezentări și figuri de publicații.

Pentru a sprijini cercetătorii în analiza și optimizarea testelor lor de formare a coloniilor, CytoSMART a introdus o aplicație pentru CytoSMART Omni pentru a detecta coloniile în imagini (time-lapse) ale unor plăci cu godeuri întregi la o mărire de 10X. În incubator, imagistica time-lapse poate furniza informații cinetice mai degrabă decât punctul final, ceea ce poate oferi informații mai detaliate despre momentul în care tratamentul începe să afecteze celulele. Analiza imaginilor fără etichetă este utilizată pentru a detecta coloniile, a evalua dimensiunea și circularitatea acestora. Identificați cu precizie momentul în care coloniile încep să fuzioneze și optimizați în consecință.

Cum să vă analizați testul clonogenic

Este într-adevăr la fel de simplu ca și cum ați număra manual coloniile pentru fiecare condiție de tratament și ați reprezenta datele sub forma unei curbe de supraviețuire (ar trebui să utilizați cel puțin trei repetări biologice pentru curba dvs.).

O curbă de supraviețuire necesită calcularea fracției de supraviețuire (SF) a celulelor tratate (aceasta include un raport dintre coloniile formate și celulele însămânțate) și reprezentarea grafică în funcție de doza de tratament. Înainte de a putea calcula SF, trebuie determinată eficiența de însămânțare (PE) a celulelor dumneavoastră, deoarece linii celulare diferite au eficiențe de însămânțare diferite și acest lucru afectează calculul fracției de supraviețuire.

PE este raportul dintre numărul de colonii și numărul de celule însămânțate în celulele dumneavoastră netratate1. Figura 1 prezintă formulele PE și SF și un exemplu de curbă de supraviețuire.

Contorizarea manuală a coloniilor este obositoare și poate fi predispusă la distorsiuni, astfel încât au fost dezvoltate o serie de instrumente computerizate de analiză a imaginilor, disponibile gratuit, pentru analiza rapidă și obiectivă a imaginilor testelor clonogenice. O mențiune demnă de menționat este pachetul software disponibil gratuit dezvoltat de Brzozowska et al. (2019), care nu numai că numără coloniile, ci și trasează distribuția dimensiunilor acestora, ceea ce reprezintă un alt strat de informații utile privind comportamentul celular (a se vedea figura 2a).6

O alternativă la numărarea și cuantificarea coloniilor individuale este determinarea procentului din suprafața godeului care este acoperit de colonii (procentul de suprafață a coloniei) pentru a cuantifica creșterea celulară clonogenică. Guzmán et al. (2014) au dezvoltat un plugin ImageJ disponibil în mod gratuit, numit ColonyArea, care face exact acest lucru (a se vedea figura 2b).7 Acesta este un instrument util de utilizat dacă aveți colonii fuzionate care sunt dificil de numărat cu ochiul liber sau cu ajutorul unui software de numărare a coloniilor sau dacă doriți o metodă de analiză rapidă și de mare randament.

Figură. 2 | Instrumente de măsurare a testelor clonogenice disponibile în mod liber. (A) Brzozowska et al. au dezvoltat un software (countPHICS) care numără coloniile și măsoară dimensiunea coloniei.6 (B) Guzmán et al. au dezvoltat un plugin ImageJ, ColonyArea, care cuantifică suprafața de creștere a coloniilor și intensitatea colorării.7

Protocol de testare clonogenică semiautomată, fără etichetă, fără punct final

O lucrare recentă a lui Mayr et al. (2018), descrie un protocol de testare clonogenică nou și modificat care utilizează un format de microplăci cu 96 de godeuri și detectarea confluenței pentru a măsura coloniile. Această metodă permite realizarea unor setări experimentale cuprinzătoare utilizând o placă cu 96 de godeuri, este lipsită de etichete, nu are un punct final de colorare, iar analiza este semiautomată (figura 3)8. Mai mult, măsurarea confluenței fără punct final, cu rezoluție în timp, a aceluiași puț, a arătat că analiza semiautomată este adecvată pentru determinarea numărului de colonii și a dimensiunii medii.

Figure. 3 | Mayr et al. au evaluat creșterea clonogenică în formatul cu 96 de godeuri în timp, utilizând detectarea confluenței8. Graficul prezintă cuantificarea creșterii clonogenice la diferite momente de timp, iar imaginile prezintă godeuri specifice cu detectarea confluenței. Petele verzi reprezintă zonele detectate de un cititor de confluență, iar săgețile portocalii indică colonii fuzionate.

Această metodă de testare clonogenică oferă o alternativă eficientă din punct de vedere al timpului și al costurilor la protocolul standard de testare clonogenică. Nefiind necesară fixarea și colorarea punctului final, acest protocol permite monitorizarea și analiza continuă a creșterii clonogenice. În plus, în timpul experimentului se pot extrage, de asemenea, parametri suplimentari privind cinetica creșterii coloniilor. Formatul miniaturizat deschide, de asemenea, oportunitatea de a testa tratamente costisitoare, cum ar fi terapiile pe bază de siRNA sau CRISPR/Cas9, care nu ar fi fezabile cu volumul de tratament necesar pentru o placă cu 6 sau 24 de godeuri. În cele din urmă, Mayr et al. au demonstrat că microscopia fără etichete cu detectarea confluenței este o opțiune robustă și viabilă pentru măsurarea clonogenității.

O soluție fără etichetă, fără punct final și automatizată pentru testele dumneavoastră clonogenice este CytoSMART Omnicu algoritmul său de detectare a coloniei. Formarea de colonii este măsurată în timp pe o întreagă fântână cu citiri ale numărului de colonii, dimensiunii și circularității. Celulele dvs. nu trebuie să părăsească incubatorul și pot fi obținute informații cinetice celulare în timpul procesului de formare a coloniilor (figura 4).

Figura 4 | Detectarea automată a coloniilor cu ajutorul CytoSMART Omni. Celulele de cancer hepatic HEP-G2 într-o placă cu 24 de godeuri au fost imaginate timp de 75 de ore cu ajutorul CytoSMART Omni, care este păstrat în interiorul unui incubator standard cu CO2. Imaginea prezintă un gode plin după rularea algoritmului de detectare a coloniilor, cu grupuri de celule evidențiate de masca portocalie pentru colonii. Numărul de colonii, dimensiunea și circularitatea au fost măsurate pe toată durata testului și o prezentate în grafice.

Aflați despre toate soluțiile de imagistică CytoSMART aici

.