Transformarea acidă a nordiazepamului poate afecta estimarea recuperării în timpul analizei urmelor de diazepam și nordiazepam în probele de apă din mediul înconjurător prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă în tandem

Sistemele de cromatografie lichidă-spectrometrie de masă cvadrupolară în tandem

Sistemele de eluție izocratică dezvoltate, precum și sistemele de eluție cu gradient au oferit o bună rezoluție a vârfurilor (Rs ≥ 3,1) pentru diazepam și nordiazepam. În sistemul izocratic, timpii de retenție au fost de 2,6 min (0,54 RSD %) și 4,1 min (0,27 RSD %) pentru standardele de nordiazepam-d5 și, respectiv, diazepam-d5. În matricea de apă de suprafață, timpii de retenție au fost aceiași ca și în cazul standardelor, iar valorile RSD au fost de 0,62 % și 0,30 % pentru nordiazepam-d5 și, respectiv, diazepam-d5. Timpii de retenție pentru standardele de lucru în sistemul de gradient au fost de 2,4 min (0,90 RSD %) și 2,9 min (0,70 RSD %) pentru nordiazepam și, respectiv, diazepam. Precizia timpilor de retenție pentru compușii din apa uzată tratată este prezentată în tabelul 1, unde valorile RSD au fost ≤ 0,35 %.

Diazepamul și nordiazepamul au fost identificate în probele de apă uzată tratată prin tranzițiile MS/MS caracteristice și timpii de retenție (tabelul 1). Un ion precursor și doi ioni de fragment au fost monitorizați pentru fiecare compus. Pentru identificarea diazepamului și nordiazepamului care apar „în mod natural”, s-au comparat raporturile dintre ariile vârfurilor obținute din cei doi ioni de fragment cu cele ale standardelor (tabelul 1). De asemenea, timpii de retenție pentru compușii țintă au fost comparați cu timpii de retenție pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 în aceeași serie cromatografică.

Dezvoltarea metodei de extracție în fază solidă

Stabilitatea diazepamului și nordiazepamului în probe apoase acide și neutre

Eșantioanele de apă de mediu colectate sunt în mod obișnuit depozitate la un pH acid înainte de analiza contaminanților emergenți . În studiul de față, stabilitatea diazepamului și nordiazepamului au fost studiate atunci când au fost stocate ca standarde de lucru (la pH 3,1 și pH 7,0). S-a constatat că nordiazepamul a fost degradat în mare măsură atunci când a fost depozitat în soluție acidă la temperatura camerei. În 12 zile, 56% din nordiazepam a fost degradat (Fig. 2). Degradarea nu a fost la fel de extinsă atunci când soluția de lucru a fost depozitată la 4 °C; după 12 zile, 20 % din concentrația inițială de nordiazepam s-a degradat. Pe de altă parte, s-a constatat că diazepamul a fost stabil la pH 3,1 atunci când a fost depozitat la temperatura camerei și la 4 °C (Fig. 2). În cele 12 zile, doar 0,53 % și 3,1 % din diazepam s-au degradat la temperatura camerei și, respectiv, la 4 °C. Ambii compuși s-au dovedit a fi stabili timp de 12 zile la pH neutru. În ziua 12, răspunsurile pentru diazepam și nordiazepam (atunci când au fost depozitate la 4 °C și la temperatura camerei) au fost de 101-103% din răspunsurile inițiale. Valorile RSD (n = 3) pentru concentrația determinată la diferite momente de timp au fost ≤ 5,1 %. Reacția a fost descoperită inițial în probele de apă uzată, dar experimentele au fost efectuate în soluții preparate pentru a simplifica condițiile și a reduce posibilitatea apariției altor reacții/efecte în matricile foarte complexe ale apelor uzate.

Stabilitatea diazepamului și nordiazepamului în acid formic 5 mM în apă purificată, pH 3. Diazepam depozitat la 4 °C (triunghi alb) și la temperatura camerei (triunghi negru). Nordiazepam depozitat la 4 °C (pătrat alb) și la temperatura camerei (pătrat negru). Detaliile experimentale sunt descrise în „Studii de stabilitate a diazepamului și nordiazepamului în soluții apoase acide și neutre”

Rezultatele noastre arată că nordiazepamul este instabil la pH 3, aceste rezultate sunt în concordanță cu rezultatele din literatura de specialitate care arată că nordiazepamul suferă hidroliză în soluții acide. Archontaki et al. au constatat că nordiazepamul a fost hidrolizat în soluții apoase acide și că prima etapă a degradării a fost reversibilă. Cu toate acestea, constatările din studiul de față pot părea contrare rezultatelor unui studiu recent în care s-a constatat că nordiazepamul (și diazepamul) erau mai stabile la pH 2 decât la pH 7 . Diferența este de fapt așteptată atunci când se iau în considerare diferitele strategii de determinare a recuperării. Deoarece transformarea nordiazepamului se inversează în timpul evaporării și încălzirii, este posibil să nu existe nicio implicație practică pentru utilizarea de rutină a metodei. Numai atunci când recuperarea este estimată în conformitate cu recomandările lui Matuszewski et al. în combinație cu instabilitatea nordiazepamului la un pH scăzut, obținem o pierdere a compusului și, prin urmare, o recuperare aparent ridicată.

Recuperările prin extracție în fază solidă pentru probe de apă de mediu simulate, stocate la un pH scăzut al probei

Recuperările prin extracție în fază solidă și efectul de matrice au fost determinate în probe de apă tratată prin LC-MS utilizând abordarea sugerată de Matuszewski et al. , detaliile sunt prezentate în „Validarea metodei”. Recuperările prin extracție au fost determinate pentru etaloanele marcate cu izotopi, diazepam-d5 și nordiazepam-d5, deoarece nu se așteaptă să se găsească compuși marcați în matricile de mediu . În studiul de față, standardele de lucru de diazepam-d5 și nordiazepam-d5 au fost depozitate în acid formic 5 mM în apă purificată pH 3,1/acetonitril (90/10, v/v), timp de cel mult 1 săptămână la 8 °C, și au fost utilizate pentru a pregăti seturile A-C.

Recuperările relative de extracție, determinate la o concentrație mică și una mare, sunt prezentate în tabelul 2 (metoda de extracție este prezentată în „Pregătirea probelor și extracția în fază solidă”). Recuperările de extracție au fost mai mari pentru nordiazepam-d5 decât pentru diazepam-d5. Pentru nordiazepam-d5, recuperările relative de extracție au fost de 114 ± 8,1 % și 117 ± 21 % la concentrația scăzută și, respectiv, ridicată. Valorile RSD obținute pentru diazepam-d5 au fost de 6,0% și 24% pentru concentrația scăzută și, respectiv, ridicată (tabelul 2). Valori ridicate ale RSD (≥ 18 %) pentru procedura de extracție în fază solidă sunt uneori obținute la determinări la nivel de urme în matrici complexe . În plus, în literatura de specialitate au fost raportate anterior recuperări de extracție ridicate (≥ 100%) pentru nordiazepam în probele de apă de mediu . După cum se va discuta mai jos, recuperările ridicate ar putea fi corelate cu un echilibru chimic între nordiazepam și un produs de transformare.

Recuperarea absolută prin extracție pentru nordiazepam-d5 a fost determinată la 139 ± 21 %, iar efectul de matrice la 119 ± 3,0 %. Recuperarea absolută ridicată a extracției pentru nordiazepam-d5 poate fi parțial explicată prin faptul că nordiazepam-d5 a fost supus intensificării ionilor în interfața MS. Cu toate acestea, am arătat că recuperările ridicate ale extracției (> 100% pentru extracția relativă, după cum s-a discutat mai sus) nu au fost cauzate doar de efectele matricei în sursa ESI. Acest lucru a fost determinat de recuperările relative de extracție obținute în conformitate cu Matuszewski et al. unde probele extrase și cele neextracte au fost injectate în sistemul LC-MS/MS dizolvate în aceeași matrice. În plus, pentru a verifica în continuare că recuperările ridicate de extracție nu au fost corelate cu niciun proces în interfața spectrometrului de masă, recuperările de extracție pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 au fost determinate prin utilizarea unei a doua tehnici de detecție, LC-UV. Recuperarea pentru o probă extrasă de nordiazepam-d5 în tampon de fosfat (pH 7,0), analizată atât cu LC-MS/MS, cât și cu LC-UV, a fost determinată ca fiind de 159 și, respectiv, 153% (n = 2). Am concluzionat că recuperările de extracție ridicate pentru nordiazepam nu au fost atribuite, în mare măsură, niciunui proces din spectrometrul de masă.

În concluzie, chiar dacă recuperările de extracție obținute și valorile RSD au fost ridicate, acestea ar părea probabil rezonabile deoarece concentrațiile compușilor țintă au fost scăzute (50 și 250 pM) și deoarece compușii au fost extrași dintr-o matrice complexă. În acest studiu, am dorit să demonstrăm că aceste recuperări ridicate obținute pentru nordiazepam ar putea fi corelate cu un echilibru chimic între nordiazepam și un produs de transformare descoperit de Archontaki et al.

Regenerarea nordiazepamului în timpul preparării probelor

Când soluțiile depozitate de diazepam și nordiazepam (pH 3.1, la temperatura camerei, „Stabilitatea diazepamului și a nordiazepamului în probe apoase acide și neutre”) au fost folosite pentru a spijini tamponul fosfat și apoi au fost supuse extracției în fază solidă, răspunsurile obținute din extractele reconstituite de nordiazepam au fost mai mari în comparație cu răspunsurile obținute din soluțiile stocate neextracte. Prin extracția în fază solidă, suprafața vârfului de nordiazepam a crescut de la 26 de numere de suprafață (2,7 RSD %, n = 3) la 45 de numere de suprafață (14,6 RSD %, n = 3).

Pentru a verifica dacă nordiazepamul a fost regenerat în timpul extracției în fază solidă, o probă stocată de nordiazepam-d5 (care a dat o arie de vârf de 1470 pentru ionul de fragment de m/z 213) și o probă prelucrată de nordiazepam-d5 (cu o arie de vârf de 1790) au fost injectate în sistemul LC-MS/MS. În plus față de canalul SRM al nordiazepam-d5 (276 → 213), au fost achiziționate două canale SRM suplimentare, Tabelul 1. Probele stocate de nordiazepam-d5 au fost injectate (n = 6), iar rapoartele tranzițiilor SRM au fost determinate ca fiind de 1,4 (3,8 RSD %, raportul ionilor fragmentari de m/z (276 → 213)/(276 → 165) și de 1,0 (3,5 RSD %, raportul ionilor fragmentari de m/z (276 → 213)/(276 → 140). Pentru proba prelucrată de nordiazepam-d5, rapoartele tranzițiilor SRM au fost aceleași, și anume, 1,4 și 1,0. Astfel, nu au existat diferențe semnificative în raporturile ionilor fragmentari între probele stocate și cele prelucrate. În plus, timpii de retenție au fost aceiași pentru ambele probe. S-a concluzionat că nordiazepam-d5 a fost nordiazepamul care a fost detectat atât în probele stocate, cât și în cele prelucrate.

Archontaki et al. au constatat că nordiazepamul a fost transformat în soluție acidă de apă, în intermediarul N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidă cu formula moleculară C15H13N2O2Cl și masa monoizotopică 288,1 Da. Produsul de transformare a fost cristalizat și analizat prin LC-UV, GC-MS, 1H- și 13C-NMR și spectroscopie IR. Echilibrul chimic al intermediarului și al nordiazepamului a fost reversibil, dar transformarea ulterioară a intermediarului în produsul final de degradare (C13H10NOCl) nu a fost totuși reversibilă. În studiul de față, un ion cu un timp de retenție de 3,0 min și un raport masă-încărcare de 289,0 a fost detectat prin LC-MS într-o soluție stocată (pH 3,1) de nordiazepam. Acest ion ar putea corespunde produsului de transformare + al nordiazepamului. În plus, modelul izotopic pentru ionul de la 3,0 min a corespuns cu modelul izotopic pentru un atom de clor. În plus, vârful cromatografic a eluat înaintea nordiazepamului, ceea ce este în concordanță cu rezultatele obținute în urma separării nordiazepamului și a N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidei în sistemul cu fază inversă utilizat de Archontaki et al. Astfel, vârful detectat în soluția de apă acidă stocată, în acest studiu, a fost cel mai probabil N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida. Mai mult decât atât, raportul dintre zona de vârf a nordiazepamului și N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamida a fost de 0,75 (n = 2) în această soluție de apă stocată în studiul prezentat. În amestecurile de metanol evaporat (detalii experimentale descrise în „Studii de stabilitate a diazepamului și nordiazepamului în soluții apoase acide și neutre”), raportul ariei de vârf al nordiazepamului la N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidă a crescut totuși la 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), adică, aria de vârf a nordiazepamului a crescut și aria de vârf a N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidei a scăzut în comparație cu proba care nu a fost evaporată. Nu au fost detectate vârfuri pentru N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidă sau nordiazepam în proba albă. Aceste rezultate sugerează cu tărie că echilibrul chimic al nordiazepamului și al produsului de transformare a nordiazepamului, caracterizat de Archontaki et al. s-a deplasat de la N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidă pentru a forma nordiazepam în timpul evaporării extractelor SPE. Nu a fost detectat niciun vârf care să poată fi corelat cu produsul final de degradare (C13H10NOCl) al nordiazepamului.

S-a concluzionat că nordiazepamul a fost ușor transformat în N-(2-benzoil-4-clorofenil)-2-aminoacetamidă în soluția acidă de apă. Interesant este faptul că nordiazepamul a fost regenerat în timpul procesului de extracție în fază solidă. Astfel, prin utilizarea soluțiilor stocate de nordiazepam la pH 3,0 ca referință în calculul recuperărilor prin extracție, recuperările prin extracție sunt supraestimate. Aceste rezultate sunt importante în timpul validării metodei, și anume în timpul evaluărilor condițiilor de depozitare, a recuperărilor prin extracție și a efectelor matricei. În plus, transformarea nordiazepamului ar putea influența rezultatele analitice globale dacă nu se utilizează un analog marcat izotopic al nordiazepamului ca standard intern. De asemenea, trebuie subliniat faptul că transformarea nordiazepamului ar putea influența acuratețea metodei, nu numai în timpul depozitării înainte de extracția în fază solidă, ci și în funcție de pH-ul soluției utilizate, de exemplu, la reconstituirea extractelor SPE uscate.

Validarea metodei

Metoda dezvoltată a fost validată prin utilizarea analogilor marcați cu izotopi, diazepam-d5 și nordiazepam-d5 („Validarea metodei”), deoarece acești compuși nu au fost detectați în probele de mediu. Avantajul utilizării analogilor marcați pentru validarea metodei constă în faptul că metoda poate fi validată la nivel de urme în matricea reală în care sunt cuantificați analiții. Recuperările relative de extracție în probele de apă uzată tratată au fost ≥ 87% pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 la concentrații ridicate și scăzute (tabelul 3). Valorile obținute se situează în limitele a ceea ce se poate aștepta atunci când concentrațiile la nivel de urme de produse farmaceutice sunt extrase din matrici complexe . Recuperările absolute de extracție au fost mai mici, 63-86%, deoarece analiții au fost supuși suprimării ionilor (tabelul 3). La concentrația scăzută, efectele matricei (ME %) au fost de 76 ± 14 % și 88 ± 14 % pentru diazepam-d5 și, respectiv, nordiazepam-d5 (tabelul 3). La concentrația ridicată, efectul matricei și valorile RSD au fost în același interval ca și la concentrația scăzută. Aceste cifre de ME % se încadrează în intervalul acceptabil, deoarece rezultatele altor studii arată că efectul de matrice obținut cu matrici de apă de mediu poate fi relativ ridicat. Precizia metodei a fost determinată prin determinarea recuperărilor SPE la concentrații scăzute și ridicate de diazepam-d5 și nordiazepam-d5 (tabelul 3). Recuperările relative au fost de 88 ± 7,6 % și 87 ± 12 % pentru diazepam-d5 la concentrația scăzută și, respectiv, ridicată, și de 98 ± 7,8 % și 99 ± 6,1 % pentru nordiazepam-d5.

Precizia sistemului cromatografic, exprimată prin valorile RSD ale timpilor de retenție obținuți pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 în probele de apă uzată extrase, a fost ≤ 0,62%. Valorile RSD ale ariilor de vârf pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 în probele de apă uzată extrase au fost ≤ 7,8% („The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems”). Mai mult, liniaritatea, exprimată prin coeficientul de corelație (R2) al curbelor de calibrare în probele de apă uzată tratată, a fost de 0,988 și 0,957 pentru diazepam și, respectiv, nordiazepam.

În acest studiu nu a fost observat niciun carryover în sistemul LC-MS/MS, deoarece nu au fost detectate vârfuri ale analiților sau ale compușilor marcați cu izotopi în niciuna dintre probele de apă purificată Millipore injectate. Nu a existat niciun indiciu că a avut loc vreo contaminare încrucișată în timpul manipulării probelor sau al extracției în fază solidă, deoarece probele de tampon fosfat extrase nu conțineau niciunul dintre compușii țintă. Prin urmare, s-a considerat că riscul de a obține rezultate fals pozitive ca urmare a autocontaminării a fost minimizat în acest studiu.

LoQ și LOD pentru diazepam-d5 și nordiazepam-d5 au fost determinate în probele de apă uzată tratată. Limitele de cuantificare au fost stabilite la 5,0 pM (1,4 ng L-1) atât pentru diazepam-d5, cât și pentru nordiazepam-d5, unde raportul semnal-zgomot a fost de aproximativ 10, iar precizia obținută a fost de 12,7 și 15,9 RSD % (n = 3) pentru compușii respectivi (tabelul 3), adică în limitele preciziei stipulate de 20% . Valorile LOQ obținute în studiul de față se încadrează în intervalul celor obținute în alte studii pentru diazepam și nordiazepam în probele de apă uzată tratată . Cu toate acestea, în acel studiu, a fost extras un volum de 200 ml de apă uzată tratată , în comparație cu 75 ml în metoda noastră prezentată. Limitele de detecție au fost de 1,7 pM (0,49 ng L-1) și 2,0 pM (0,55 ng L-1) pentru diazepam-d5 și, respectiv, nordiazepam-d5 (tabelul 3).

Așa cum s-a discutat mai sus („Stabilitatea diazepamului și nordiazepamului în probe apoase acide și neutre”, Fig. 2), s-a demonstrat că diazepamul și nordiazepamul sunt stabile timp de 12 zile la un pH al probei de 7.0 atunci când sunt depozitate la temperatura camerei sau la 4 °C.

Cantificarea diazepamului și nordiazepamului în probe de apă de mediu

Metoda LC-MS/MS dezvoltată a fost aplicată la probe de apă de mediu pentru determinarea diazepamului și nordiazepamului. Trebuie subliniat faptul că metoda dezvoltată poate fi utilizată pentru determinarea diazepamului și nordiazepamului în probe de mediu în condiții acide, dacă în probe se adaugă standarde interne ideale înainte de depozitare, adică compuși marcați izotopic ai compușilor țintă. În acest studiu, compușii marcați cu izotopi, diazepam-d5 și nordiazepam-d5, au fost utilizați ca standarde interne pentru a compensa potențiala transformare a compușilor și alte pierderi, precum și variațiile din timpul analizei.

Eșantioane de apă uzată tratată și apă de suprafață au fost analizate pentru diazepam și nordiazepam. Nu au existat diferențe semnificative, la nivelul de 5% într-un test t, între raporturile ionice obținute pentru soluțiile standard (tabelul 1) și cele obținute pentru diazepamul sau nordiazepamul „natural” (P ≥ 0,07). Concentrațiile de diazepam și nordiazepam au fost determinate ca fiind de 8,5 (2,4 ng L-1) și, respectiv, 66 pM (18 ng L-1). În probele de la aceeași stație de tratare a apelor reziduale colectate 14 zile mai târziu, concentrațiile au fost determinate ca fiind de 7,5 (2,1 ng L-1) și 75 pM (20 ng L-1) pentru diazepam și, respectiv, nordiazepam. Astfel, concentrațiile de nordiazepam au fost determinate ca fiind cu aproximativ un ordin de mărime mai mari decât cele pentru diazepam. Aceste rezultate sunt în concordanță cu rezultatele altor studii privind efluenții de apă uzată . Mai mult, în unele probe de apă uzată tratată, raportate în literatura de specialitate, nordiazepamul a fost cuantificat, dar diazepamul nu a fost detectat . În studiul de față, nici diazepamul, nici nordiazepamul nu au fost detectate în apele de suprafață colectate din râul Fyris, la 3 km în amonte de stația de tratare a apelor uzate Kungsängsverket, ceea ce indică puține emisii antropice de ape uzate în amonte.

.