Înotând într-o mare de celule: De ce genomica monocelulară?
Sistemele biologice complexe rezultă din funcția coordonată a celulelor individuale care execută un „dans” complicat, fiecare contribuind cu rolul său special la acest ansamblu. Din cauza acestei complexități, cercetarea expresiei genice în organisme, țesuturi sau populații de celule este adesea limitată prin utilizarea metodelor tradiționale de secvențiere a ARN-ului în masă. În calitate de oameni de știință, înțelegem intuitiv că, atunci când „măcinăm și găsim” pentru a efectua experimente pe amestecul nostru diluat de ARN, obținem de fapt doar o mică idee despre ceea ce s-ar putea întâmpla în celulele noastre de interes: diferențele de la celulă la celulă sunt ratate, iar eterogenitatea celulară poate fi complet mascată. De fapt, analiza expresiei ARN-ului în masă descrie adesea o stare dedusă în care nu există de fapt niciuna (sau foarte puține) dintre celule!
Poate că sunteți un cercetător în neuroștiințe, care lucrează în creierul de șoarece, studiind dezvoltarea unei subpopulații de neuroni care produc un neurotransmițător specific. Dacă ați putea să izolați acea populație și să o analizați celulă cu celulă, cunoștințele potențiale ar fi, într-adevăr, stimulative din punct de vedere neuronal! În mod similar, în cazul cercetării în domeniul cancerului: cum puteți distinge cel mai bine expresia genetică și, poate mai important, eterogenitatea celulară, într-o tumoare? Cum ar fi dacă ați putea compara nu numai diferențele inter-tumorale, ci și cele intra-tumorale și ați putea explora populațiile de celule imune legate de micro-mediul tumoral? Această diversitate, adeseori ascunsă de metodele RNA-seq de masă, poate fi dezvăluită prin utilizarea RNA-seq cu o singură celulă pentru a explora în mod specific aceste populații de celule semnificative din punct de vedere clinic. Exemplele de dezavantaje ale analizei bulk sunt abundente, iar disecarea diferențelor de tip celular în majoritatea, dacă nu în toate aceste sisteme biologice complexe, este esențială pentru înțelegerea contribuțiilor lor, în special în timpul dezvoltării și în progresia bolii.
Cum izolăm și analizăm celulele unice?
Tehnologia RNA-seq (scRNA-seq) monocelulară (scRNA-seq) de la 10x Genomics, Chromium™ Single Cell 3′ Solution, vă permite să analizați transcriptomii celulă cu celulă prin utilizarea partiționării microfluidice pentru a captura celule unice și a pregăti biblioteci de ADNc cu cod de bare, pentru secvențiere de generație următoare (NGS). Mai exact, celulele unice, reactivii de transcriere inversă (RT), Gel Beads conținând oligonucleotide cu cod de bare și uleiul sunt combinate pe un cip microfluidic pentru a forma vezicule de reacție numite Gel Beads in Emulsion, sau GEMs. GEM-urile sunt formate în paralel în canalele microfluidice ale cipului, permițând utilizatorului să proceseze de la 100 până la 10 000 de celule unice într-o singură rulare de 7 minute a instrumentului Chromium™. Este important de reținut că celulele sunt încărcate la o diluție limită pentru a maximiza numărul de GEM-uri care conțin o singură celulă pentru a asigura o rată scăzută de dubleți, menținând în același timp o rată ridicată de recuperare a celulelor de până la ~65%.
Care GEM funcțional conține o singură celulă, o singură perlă de gel și reactivi RT. În cadrul fiecărei vezicule de reacție GEM, o singură celulă este lizată, Gel Bead-ul este dizolvat pentru a elibera oligonucleotidele RT cu cod de bare identic în soluție și are loc transcrierea inversă a ARNm poliadenilat. Ca urmare, toate ADNc provenite dintr-o singură celulă vor avea același cod de bare, permițând ca citirile de secvențiere să fie cartografiate înapoi la celulele unice originale de origine. Pregătirea bibliotecilor NGS din aceste ADNc cu coduri de bare se realizează apoi printr-o reacție în masă foarte eficientă. Videoclipul de mai jos oferă o explicație vizuală excelentă a modului în care funcționează toate acestea.
De la pregătirea probelor la videoclipuri „how-to”: Link-uri utile pentru a începe
Fluxul de lucru Chromium Single Cell 3′ începe cu celulele dvs. de interes, urmat de construirea bibliotecii NGS folosind kiturile noastre de reactivi și Chromium Controller. Pregătirea bibliotecii dvs. de ADNc cu cod de bare (așa cum este descrisă în general în videoclipul de mai sus) este un pas important și, conform zicalei „garbage in, garbage out” – pregătirea suspensiilor celulare de înaltă calitate este esențială pentru a obține cele mai bune rezultate sau datele dvs. de ARN-seq. Dacă aveți nevoie de asistență în procesul de pregătire a celulelor, avem mai multe protocoale demonstrate disponibile pe site-ul nostru web, cum ar fi disocierea țesutului neuronal sau pregătirea suspensiilor de protoplaste de mușchi pentru utilizarea în scRNA-seq, alte protocoale fiind adăugate în mod regulat pe site-ul nostru de asistență. Pentru îndrumare și recomandări cu privire la modul optim de pregătire a probelor dvs. odată ce acestea sunt în suspensie, un bun punct de plecare este ghidul nostru de pregătire a celulelor unice, unde puteți afla mai multe despre cele mai bune practici și puteți vizualiza un protocol general. Dacă vă place mai mult să învățați vizual, videoclipurile noastre cu instrucțiuni, în special capitolele 4-7, ar trebui să vă ajute să vă ghidați prin procesul de pregătire a eșantioanelor și bibliotecilor.
-
Single Cell Prep Guide
-
Demonstrated Protocols
-
How-to-videos
-
Chromium™ Controller
-
User Guides
-
User Guides
-
How-to-videos
-
Software Cell Ranger™
-
Loupe™ Cell Browser
-
How-to-videos
Analizând datele dumneavoastră, câte o celulă la un moment dat
După ce biblioteca dvs. este pregătită, secvențierea se realizează cu ajutorul instrumentelor de secvențiere Illumina®. Acest lucru duce la partea distractivă: culegerea de informații biologice din datele RNA-seq ale celulei dvs. unice! Cantitatea (potențial) masivă de date pe care o generați de la Chromium Single Cell Single Cell 3′ Solution poate fi gestionată cu ușurință de software-ul și instrumentele noastre de vizualizare care au fost concepute pentru a elimina o mare parte din presupuneri – Software-ul Cell Ranger™ transformă datele de secvențiere cu cod de bare în fișiere pregătite pentru analiza expresiei celulelor unice, iar vizualizarea se realizează prin intermediul Loupe™ Cell Browser. Dacă doriți un tutorial pas cu pas privind utilizarea software-ului nostru, capitolele 8-11 din videoclipurile noastre despre cum se utilizează acoperă totul, de la numărarea transcrierilor cu Cell Ranger Software până la vizualizarea frumoasă a datelor cu Loupe Cell Browser. Există, de asemenea, un număr tot mai mare de instrumente de analiză a celulelor unice dezvoltate de comunitate, inclusiv Seurat, Monocle și Cell View. Citiți mai multe despre aceste instrumente de analiză și alte articole despre celula unică pe blogul 10x Genomics, unde evidențiem contribuții importante în domeniul cercetării, oferim sfaturi și trucuri și vă ținem la curent cu tot ceea ce ține de celula unică!
Dacă aveți alte întrebări sau nelămuriri cu privire la începerea utilizării Chromium Single Cell 3′ Solution, nu ezitați să lăsați un comentariu aici sau să ne contactați direct. Fie că este vorba de urmărirea dezvoltării organoizilor cerebrali, de studierea transplantului de măduvă osoasă la pacienții cu leucemie mieloidă acută sau de deslușirea unei căi noi de auto-reînnoire a celulelor stem intestinale, numărul publicațiilor Chromium Single Cell crește zilnic și așteptăm cu nerăbdare să aflăm despre toate cercetările dvs. uimitoare!