Obiectivul general al acestui test de inhibiție a hemaglutinării este de a măsura titlurile de anticorpi împotriva unor virusuri specifice de interes. Această metodă poate ajuta să răspundă la întrebări cheie în domeniul vaccinologiei cu privire la imunitatea și protecția mediată de vaccin în cadrul diferitelor populații și în diferite grupe de vârstă și de pacienți. Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt că este precisă și că permite determinarea rapidă a titrului prezenței anticorpilor neutralizanți.
Deși această metodă poate oferi o perspectivă asupra titlurilor de anticorpi umani, ea poate fi aplicată și la alte sisteme, cum ar fi titlurile de anticorpi pentru serul de șoarece, de asemenea, supranaturile de cultură. Începeți prin etichetarea plăcilor de microtitrare cu 96 de godeuri cu informațiile experimentale corespunzătoare. Apoi întoarceți placa în orientare verticală și folosiți o pipetă cu mai multe canale pentru a adăuga 25 microlitri de PBS în fiecare puț, cu excepția primului puț din rândul inferior de titrare inversă.
Adaugați 50 microlitri de soluție de antigen proaspăt preparată de interes în primul puț din rândul de titrare inversă, urmată de adăugarea a 25 microlitri de probe de ser tratate cu RDE în primele puțuri din primele zece rânduri. Se adaugă 25 microlitri de antiserum corespunzător în primul puț al celui de-al 11-lea rând ca martor pozitiv. Se transferă 25 microlitri din primul puț al fiecărui rând în puțurile lor succesive pentru a realiza diluții în serie, de două ori.
Pipetă în sus și în jos de 10 până la 15 ori pentru fiecare etapă de diluție, aruncând ultimii 25 microlitri din ultimele puțuri. Apoi, adăugați 25 microlitri din soluția de antigen în fiecare gode din rândurile de la 1 la 11 și 25 microlitri de PBS numai în fiecare gode din rândul de titrare din spate. Bateți cu grijă placa de 10 ori pe toate cele patru laturi pentru a amesteca.
Apoi acoperiți placa timp de 30 de minute la temperatura camerei. La sfârșitul incubării, adăugați 50 microlitri de soluție de hematii în fiecare gode și amestecați placa cu mai multe bătăi. Apoi se acoperă din nou placa și se incubează eritrocitele în funcție de specia utilizată, așa cum este prezentat în tabel.
După adăugarea eritrocitelor în placă, se respectă timpul de incubare adecvat pentru tipul de sânge utilizat în analiză. O incubare prea scurtă sau prea lungă va duce la o interpretare incorectă a rezultatelor. La sfârșitul incubării, evaluați hemaglutinarea înclinând placa la 90 de grade timp de 25 de secunde și marcați rezultatele pentru fiecare gode, în timp ce placa este încă înclinată, pe o schemă tipărită a plăcii cu 96 de godeuri.
În acest experiment, răspunsul anticorpilor indus de vaccin a fost evaluat la 26 de voluntari sănătoși care au primit un vaccin gripal trivalent inactivat care conținea virusul gripal A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 și B/Massachusetts/O2/2012 înainte de sezonul gripal 24 2015. S-a observat un răspuns imunitar reactiv încrucișat pentru tulpinile de virus A/H3N2/Elveția/2013 și A/H3N2/Texas/2012, cu titruri medii geometrice de inhibiție a hemaglutinării semnificativ mai mici și seroprotecție indusă împotriva gripei A/H3N2/Elveția/2013 în comparație cu gripa A/H3N2/Texas/2012. După vaccinare, titlurile de anticorpi împotriva ambelor tulpini au crescut, chiar dacă tulpina A/H3N2/Elveția/2013 nu a fost prezentă în vaccin.
Hemaglutinina virală demonstrează un potențial de hemaglutinare a eritrocitelor dependent de specie. Este interesant faptul că sângele de cobai nu hemaglutinează corespunzător cu gripa B, iar sângele de curcan are potențial de hemaglutinare cu titruri ridicate și o reactivitate încrucișată scăzută. Odată stăpânită, această tehnică poate fi finalizată în cele trei ore, dacă este efectuată corect.
În timp ce se încearcă această procedură, este important să nu uitați să luați serul cu RDE pentru a inactiva orice inhibitori nespecifici și legături nespecifice în timpul hemaglutinării virusului. În urma acestei proceduri, se pot efectua alte metode, cum ar fi ELISA, pentru a răspunde la întrebări suplimentare cu privire la rolul imunoglobulinelor individuale specifice agentului patogen. După ce a fost dezvoltată, această tehnică a deschis calea cercetătorilor din domeniul imunologiei virale pentru a aprofunda înțelegerea imunității legate de vaccinuri la pacienții sănătoși și imunodeprimați din diferite grupe de vârstă.
După ce ați vizionat acest videoclip, ar trebui să înțelegeți bine cum se realizează un test de inhibiție a hemaglutinării pentru a cuantifica titlurile de anticorpi specifici tulpinii de gripă pe scară largă. Nu uitați că lucrul cu antigeni virali, sânge de animale și probe de ser uman poate fi extrem de periculos și că trebuie luate întotdeauna măsuri de precauție, cum ar fi lucrul într-un laborator BSL2, în timpul efectuării acestei proceduri.
.