Gerät und Reagenzien
Das Gerät für den MTX-Nachweis war das Siemens VIVA-E, das durch die Verfügbarkeit eines offenen Kanals eine individuelle Anpassung der Parameter ermöglicht. MTX-Reagenzien und Kalibratoren wurden von Siemens (6L119UL) bezogen.
Drei Stufen von Qualitätskontrollmaterial (QC) wurden von Bio-Rad (Irvine, CA) bezogen, ein zusätzliches kundenspezifisches QC-Material mit 0,05 μmol/L von Aladdin (Shanghai, China).
Der Vergleich der MTX-Methode wurde durch die Analyse derselben Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durchgeführt (LC-20 AD Flüssigchromatographie und AB SCIEX QTRAP®4500 Massenspektrometer).
Proben
Die Testproben wurden von der hämatologischen Abteilung des Kinderkrankenhauses von Dalian bezogen. Einige getestete Proben und MTX-freie ikterische Plasmaproben wurden zur Untersuchung der Triglycerid- und Bilirubin-Interferenz gesammelt. Es gab keinen Eingriff in die Behandlung der Patienten, und es wurden keine individuellen Informationen der Patienten erwähnt.
Reagenzienvorbereitung
Das Siemens Reagenzienkit enthält Antikörper-/Substratreagenz A, Enzymreagenz B, Emit Drug Assay Buffer Concentrate und Emit Methotrexat-Kalibratoren. Reagenz A und B wurden mit 3,0 ml deionisiertem Wasser rekonstituiert, durch leichtes Schwenken gemischt und 1 h lang bei Raumtemperatur äquilibriert. MTX-Pufferkonzentrat wurde mit deionisiertem Wasser gemischt (1:15 v/v). Arbeitslösungen der Reagenzien A und B wurden durch Verdünnen der Stammlösungen im Verhältnis 1:9 v/v mit Pufferlösung hergestellt.
Einige Kalibratoren (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) wurden in der angegebenen Konzentration mit 1.0 mL deionisiertem Wasser gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert, andere Kalibratoren (1,50 und 2,00 μmol/L) wurden mit 1,50 bzw. 2,00 mL deionisiertem Wasser auf 1,00 μmol/L rekonstituiert. Anschließend wurde der 0,20 μmol/L-Kalibrator auf 0,05 μmol/L und der 1,00 μmol/L-Kalibrator auf 0,10 und 0,25 μmol/L verdünnt. Der neue Satz von Kalibratoren (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 und 1,00 μmol/L) erfüllt die Anforderungen der modifizierten Kalibrierkurve.
Programmierung des Viva-E-Instruments
Ein offener Kanal auf dem Viva-E wurde programmiert, um die Volumina der Reagenzien A & B von 180 μL auf 110 μL zu ändern (110 μL ist die untere Grenze des Viva-E für MTX-Reagenzien). Eine Sechs-Punkte-Kalibrierkurve wurde mit modifizierter kubischer Spline-Regression programmiert. Die sechs im Kit enthaltenen Kalibratoren waren 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 und 2,00 μmol/L. Wenn die Volumina der Reagenzien A und B verringert wurden, reichten sie nicht aus, um mit Proben von mehr als 1 μmol/L zu reagieren. Daher wurde das neue Kalibratorset des modifizierten EMIT-Assays auf 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L in einem Bereich von 0,05 bis 1,00 μmol/L geändert.
Gemäß der Anleitung des kommerziellen Kits sollten die Proben mit einer Konzentration von mehr als 1,00 μmol/L in den Bereich der Kalibrierungskurve verdünnt werden (0.05-1.00 μmol/L) mit einem Verdünnungsfaktor von 10, 100 oder 1000 verdünnt werden.
Leerwertgrenze, Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze
Leerwertgrenze (LOB), Nachweisgrenze (LOD), Bestimmungsgrenze (LOQ) wurden gemäß CLSI EP17-A bestimmt. Die LOB wurde anhand von sechs Proben (S1-S6, 10 Wiederholungen über 10 Tage) bestimmt: S1 und S2 waren Nullkalibratoren aus zwei verschiedenen Kalibratorchargen, S3 und S4 waren Verdünnungsmittel, S5 und S6 waren Leerplasma. Die LOD wurde mit 5 Low-Level-Probenpools bestimmt, die von der LOB bis zum Vierfachen der LOB reichten (12 Wiederholungen über 12 Tage). LOB und LOD wurden mit zwei Chargen von Reagenzien bestimmt. Entsprechend den klinischen Anforderungen wurde das Ziel für den Gesamtfehler auf 20 % festgelegt. Die Testergebnisse der LOD-Studie wurden verwendet, um die Verzerrung und Ungenauigkeit für jede Stufe des Analyten zu schätzen. Anschließend wurden diese Daten kombiniert, um den Gesamtfehler auf jeder Stufe zu schätzen und die Bestimmungsgrenze (LOQ) zu bestimmen.
Ungenauigkeit innerhalb eines Tages und zwischen zwei Tagen
Die Ungenauigkeit des modifizierten Assays wurde innerhalb eines Tages (n = 10) anhand einer Stufe von Kontrollmaterialien (0,05 μmol/L) und drei Stufen von Patientenproben (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L) bewertet. Für jede Stufe wurden 10 Wiederholungen durchgeführt. Die Ungenauigkeit zwischen den Tagen (n = 25) wurde bei diesen 4 Stufen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und 5 Wiederholungen für jede Stufe getestet. Alle Proben stammten von verschiedenen Patienten. Die gemessenen Ergebnisse wurden gegen die erwarteten Werte aufgetragen.
Linearität
Die Linearität wurde durch Verdünnung der Qualitätskontrolle von 2,00 μmol/L (hc) mit Puffer (c0) in den folgenden Verhältnissen überprüft: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Jede Verdünnung wurde dreimal analysiert, die Linearitätsgleichung des modifizierten Assays wurde auf der Grundlage der Mittelwerte der gemessenen Ergebnisse und der erwarteten Werte berechnet.
Das LC-MS/MS-Assay-Verfahren
Der in dieser Studie durchgeführte LC-MS/MS-Assay ist wie folgt. Diphenhydramin wurde als interner Standard verwendet. Acetonitril wurde als Serum-Fällungsmittel verwendet, um Albumin zu eliminieren. Für die LC-Trennung wurde eine Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) Säule verwendet. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Ameisensäure und Acetonitril. Die Gradientenelution erfolgte bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und 30 °C. MTX und Diphenhydramin wurden im Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus in der Elektrospray-Ionisierungsquelle (ESI) und im Positiv-Ionen-Scan-Modus nachgewiesen. MTX wurde bei m/z 455,0 → 308,1 und Diphenhydramin bei m/z 256,0 → 167,0 nachgewiesen.
Methodenvergleich
Neunundsiebzig Proben wurden von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie in der hämatologischen Abteilung des Kinderkrankenhauses Dalian entnommen. Jede Probe wurde mit dem modifizierten EMIT-Assay bzw. dem LC-MS/MS-Assay untersucht. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einfachen linearen Regressionsanalyse (MedCalc Statistical Software Version 15.6.1) verglichen. Weitere 45 Proben wurden mit dem modifizierten EMIT-Assay und dem kommerziellen EMIT-Assay zum Methodenvergleich getestet.
Interferenzstudien
Triglycerid-Interferenz wurde durch die Vorbereitung von Proben mit Intralipid (20%ige IV-Fettemulsion) bewertet. Die Konzentration der Triglyceride in den Proben betrug 1000 ng/dL. Dann wurde der Paired-T-Test durchgeführt.
Die Bilirubin-Interferenz wurde anhand einiger MTX-freier ikterischer Plasmaproben mit einer Bilirubinkonzentration von nicht weniger als 30 mg/dL simuliert.
Die Interferenz durch den strukturell verwandten Metaboliten 7-Hydroxy-Methotrexat wurde durch Zugabe verschiedener Mengen von 7-Hydroxy-Methotrexat zu den Plasmaproben bewertet; die MTX-Konzentration in diesen Proben betrug 0,05 μmoL/L. Und die Testergebnisse der aktuellen Proben wurden mit den Ergebnissen der ursprünglichen Proben verglichen.