Tabla 1
Excitación, emisión y brillo
Si planea utilizar varias etiquetas fluorescentes, es importante elegir una con picos de emisión distintos, así como picos de excitación a los que pueda dirigirse con sus láseres disponibles. Si los picos de emisión se superponen, será difícil, o posiblemente imposible, diferenciarlos.
Típicamente se quiere la etiqueta fluorescente más brillante dentro de sus espectros disponibles para lograr una señal clara y superar cualquier fluorescencia de fondo potencial. Los valores de brillo son un producto del coeficiente de extinción de la proteína y del rendimiento cuántico. Sin embargo, el número resultante puede ser difícil de interpretar, por lo tanto, el brillo de una etiqueta fluorescente en relación con una etiqueta bien definida, como EGFP, es una medida alternativa común.
Maduración y blanqueo
La maduración define el tiempo que tarda una etiqueta fluorescente en plegarse correctamente, formar el cromóforo y comenzar a fluorescer. Para eventos sensibles al tiempo en células vivas, un tiempo de maduración corto puede ser importante. La GFP supercargada (sfGFP), por ejemplo, puede plegarse en menos de 10 minutos, mientras que la mOrange puede tardar más de cuatro horas.
El blanqueo es una medida de la fotoestabilidad, es decir, cuánto tiempo después de la excitación el cromóforo pierde la capacidad de emitir luz. Si planea realizar experimentos de larga duración, considere una etiqueta con una alta fotoestabilidad. El zafiro T tiene una vida media de blanqueo (t½; tiempo para que una tasa de emisión inicial de x fotones/s se reduzca a la mitad) de 25 segundos, pero la EGFP es mucho más estable, con un t½ de blanqueo de 174 segundos.
Condiciones ambientales
Como la mayoría de las proteínas, las etiquetas fluorescentes se ven afectadas por el pH, la temperatura y los niveles de oxígeno. Dependiendo del entorno que piense utilizar, es posible que tenga que ajustar ligeramente las condiciones o seleccionar una etiqueta más apropiada.
El pH puede afectar a los picos de excitación y emisión, y la mayoría de las etiquetas fluorescentes son sensibles al ácido: algunas pueden incluso cambiar la intensidad fluorescente ante cambios de pH (por ejemplo, pHTomato). El valor pKa es un buen indicador de la sensibilidad al pH, ya que muestra el pH al que la mitad de los cromóforos son fluorescentes.
Además, la temperatura y los niveles de oxígeno afectan a los tiempos de maduración: las condiciones de hipoxia tienden a retrasar los tiempos de maduración, al igual que las temperaturas fuera del rango óptimo de las etiquetas fluorescentes (por ejemplo, EGFP se ha optimizado para funcionar a 37°C). Sin embargo, las etiquetas fluorescentes más recientes, como la UnaG, una GFP aislada de la anguila japonesa de agua dulce (Anguilla japonica), es fluorescente incluso cuando los niveles de oxígeno son bajos3.
Optimización de codones
Como la mayoría de las etiquetas fluorescentes se derivan de proteínas de medusas o corales, en lugar de algo parecido a las células y tejidos de mamíferos en los que es probable que se utilicen, puede haber una diferencia entre especies en los codones de aminoácidos utilizados. Esto puede dar lugar a una expresión pobre y, por tanto, a una señal baja.
Afortunadamente, muchas de las versiones más recientes de las etiquetas fluorescentes han sido optimizadas en cuanto a codones para reflejar las preferencias de las células de mamíferos. En la GFP, por ejemplo, Jürgen Haas y sus colegas mejoraron la señal entre 40 y 120 veces modificando la secuencia del codón de la GFP4.
Si está utilizando un plásmido más antiguo para generar sus proteínas de fusión, es posible que no contenga una secuencia de etiqueta fluorescente modificada. Por ello, compruebe siempre si su secuencia ha sido modificada para su uso en una especie determinada.
Oligomerización
Es importante determinar si su etiqueta es un monómero o un dímero (los monómeros se suelen indicar con una «m» como prefijo del nombre de la proteína, por ejemplo, mCherry), y si esto afecta o no a su experimento. Muchas de las primeras etiquetas fluorescentes eran propensas a formar oligómeros, y la oligomerización puede afectar a la función biológica de la proteína de fusión. La EGFP, por ejemplo, es un monómero que puede formar dímeros cuando se utiliza en concentraciones suficientemente altas, lo que puede distorsionar los orgánulos subcelulares5 o interrumpir experimentos como el FRET6. En la gran mayoría de los casos se recomiendan las PFs verdaderamente monoméricas.
Productos GFP y mCherry