Instrumento y reactivos
El instrumento para la detección de MTX fue Siemens VIVA-E que permite la personalización de los parámetros gracias a la disponibilidad de un canal abierto. Los reactivos y calibradores de MTX se adquirieron de Siemens (6L119UL).
Se adquirieron tres niveles de material de control de calidad (QC) de Bio-Rad (Irvine, CA), un material QC adicional personalizado a 0,05 μmol/L de Aladdin (Shanghai, China).
La comparación del método MTX se realizó analizando las mismas muestras mediante un ensayo de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (cromatografía líquida LC-20 AD, y espectrómetros de masas AB SCIEX QTRAP®4500).
Especímenes
Las muestras de ensayo se obtuvieron de la sala de hematología del hospital infantil de Dalian. Se recogieron algunas muestras analizadas y muestras de plasma ictérico sin MTX para estudiar la interferencia de los triglicéridos y la bilirrubina. No se intervino en el tratamiento de los pacientes y no se mencionó ninguna información individual de los mismos.
Preparación de los reactivos
El kit de reactivos Siemens contiene el reactivo de anticuerpos/sustrato A, el reactivo enzimático B, el concentrado de tampón de ensayo de fármacos Emit y los calibradores de metotrexato Emit. Los reactivos A y B se reconstituyeron con 3,0 mL de agua desionizada, se mezclaron agitando suavemente y se equilibraron a temperatura ambiente durante 1 h. El concentrado de tampón MTX se mezcló con agua desionizada (1:15 v/v). La solución de trabajo de los reactivos A y B se preparó diluyendo las soluciones madre 1:9 v/v con solución tampón.
Algunos calibradores (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) se reconstituyeron hasta la concentración indicada con 1.0 mL de agua desionizada según las instrucciones del fabricante, otros calibradores 1,50 y 2,00 μmol/L se reconstituyeron a 1,00 μmol/L con 1,50 y 2,00 mL de agua desionizada respectivamente. A continuación, el calibrador de 0,20 μmol/L se diluyó en 0,05 μmol/L, y el de 1,00 μmol/L se diluyó en 0,10 y 0,25 μmol/L. El nuevo conjunto de calibradores (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 y 1,00 μmol/L) cumple los requisitos de la curva de calibrador modificada.
Programación del instrumento Viva-E
Se programó un canal abierto en el Viva-E para cambiar los volúmenes de los reactivos A & B de 180 μL a 110 μL (110 μL es el límite inferior del Viva-E para los reactivos MTX). Se programó una curva de calibración de seis puntos con regresión spline cúbica modificada. Los seis calibradores proporcionados por el Kit fueron 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 y 2,00 μmol/L. Cuando se disminuyeron los volúmenes de los reactivos A y B, no fueron suficientes para reaccionar con muestras de más de 1 μmol/L. Como resultado, el nuevo conjunto de calibradores del ensayo EMIT modificado se cambió a 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L dentro de un rango de 0,05 a 1,00 μmol/L.
De acuerdo con las instrucciones del kit comercial, las muestras de concentración superior a 1,00 μmol/L deben diluirse en el ámbito de la curva de calibración (0.05-1,00 μmol/L) utilizando un factor de dilución de 10, 100 o 1000.
Límite de blanco, límite de detección, límite de cuantificación
Límite de blanco (LOB), límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) se determinaron de acuerdo con CLSI EP17-A . El LOB se ensayó utilizando seis muestras (S1-S6, 10 réplicas durante 10 días): S1 y S2 eran calibradores cero de dos lotes de calibradores diferentes, S3 y S4 eran diluyentes, S5 y S6 eran plasma en blanco. El LOD se ensayó con 5 grupos de muestras de bajo nivel que iban desde el LOB hasta cuatro veces el LOB (12 réplicas durante 12 días). El LOB y el LOD se determinaron con dos lotes de reactivos. De acuerdo con los requisitos clínicos, el objetivo de error total se fijó en el 20%. Los resultados del estudio LOD se utilizaron para estimar el sesgo y la imprecisión para cada nivel del analito. Luego, estos datos se combinaron para estimar el error total en cada nivel y determinar el límite de cuantificación (LOQ).
Imprecisión intradiaria e interdiaria
La imprecisión intradiaria (n = 10) del ensayo modificado se evaluó mediante un nivel de materiales de control (0,05 μmol/L) y tres niveles de muestras de pacientes (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). En cada nivel se realizaron 10 réplicas. Se probó la imprecisión interdiaria (n = 25) en estos 4 niveles en 5 días consecutivos, y 5 réplicas para cada nivel. Todas las muestras se obtuvieron de diferentes pacientes. Los resultados medidos se graficaron contra los valores esperados.
Linealidad
La linealidad se verificó diluyendo el control de calidad de 2,00 μmol/L (hc) con tampón (c0) en las siguientes proporciones: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Cada dilución se analizó tres veces, la ecuación de linealidad del ensayo modificado se calculó con base en las medias de los resultados medidos y los valores esperados.
El procedimiento de ensayo LC-MS/MS
El ensayo LC-MS/MS realizado en este estudio es el siguiente. Se utilizó difenhidramina como estándar interno. Se utilizó acetonitrilo como precipitante del suero para eliminar la albúmina. Se utilizó una columna Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) para las separaciones LC. La fase móvil fue ácido fórmico al 0,1% y acetonitrilo. La elución en gradiente se realizó a un flujo de 0,5 mL/min a 30 °C. Se utilizó el modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM) para detectar MTX y difenhidramina en la fuente de ionización por electrospray (ESI) y el modo de barrido de iones positivos. El MTX se detectó a m/z 455,0 → 308,1, la difenhidramina se detectó a m/z 256,0 → 167,0 .
Comparación de métodos
Se recogieron 79 muestras de pacientes con leucemia linfoblástica aguda en la sala de hematología del hospital infantil de Dalian. Cada muestra se analizó mediante el ensayo EMIT modificado y el ensayo LC-MS/MS respectivamente. Los resultados se compararon mediante un análisis de regresión lineal simple (software estadístico MedCalc versión 15.6.1). Se analizaron otras 45 muestras utilizando el ensayo EMIT modificado y el ensayo EMIT comercial para comparar los métodos.
Estudios de interferencia
La interferencia de los triglicéridos se evaluó preparando las muestras con Intralipid (emulsión de grasa IV al 20%). La concentración de triglicéridos en las muestras fue de 1000 ng/dL. A continuación se realizó la prueba Paired-T.
La interferencia de la bilirrubina se simuló utilizando algunas muestras de plasma ictérico sin MTX con una concentración de bilirrubina no inferior a 30 mg/dL.
La interferencia del metabolito estructuralmente relacionado 7-hidroxi-metotrexato se evaluó añadiendo diferentes niveles de 7-hidroxi-metotrexato a las muestras de plasma, la concentración de MTX en esas muestras fue de 0,05 μmoL/L. Y los resultados de las pruebas de las muestras actuales se compararon con los resultados de las muestras originales.