Uiminen solujen meressä:
Kompleksiset biologiset järjestelmät ovat tulosta yksittäisten solujen koordinoidusta toiminnasta, jotka suorittavat monimutkaista ”tanssia”, ja kukin solu antaa oman erityisroolinsa kokonaisuuteen. Tämän monimutkaisuuden vuoksi organismien, kudosten tai solupopulaatioiden geeniekspression tutkimusta rajoitetaan usein käyttämällä perinteisiä bulk RNA-seq-menetelmiä. Tutkijoina ymmärrämme intuitiivisesti, että kun ”jauhamme ja löydämme” tehdessämme kokeita laimennetulla RNA-sekoituksellamme, saamme todellisuudessa vain pienen käsityksen siitä, mitä kiinnostavissa soluissa saattaa tapahtua: solujen väliset erot jäävät huomaamatta, ja solujen heterogeenisuus voidaan peittää kokonaan. Itse asiassa bulkki-RNA:n ilmentymisanalyysi kuvaa usein oletettua tilaa, jossa yhtään (tai hyvin harvoja) soluja ei todellisuudessa ole!
Ehkä olet neurotieteilijä, joka työskentelee hiiren aivoissa ja tutkii tiettyä välittäjäainetta tuottavien neuronien osapopulaation kehitystä. Jos vain voisit eristää kyseisen populaation ja analysoida sitä solukohtaisesti, mahdolliset oivallukset olisivat todellakin hermostollisesti stimuloivia! Sama pätee myös syöpätutkimukseen: miten erottaa parhaiten toisistaan geeniekspressio ja, mikä ehkä vielä tärkeämpää, solujen heterogeenisuus kasvaimessa? Entä jos voitaisiin vertailla paitsi kasvainten välisiä myös kasvaimen sisäisiä eroja ja tutkia kasvaimen mikroympäristöön liittyviä immuunisolupopulaatioita? Tämä moninaisuus, joka usein peittyy RNA-seq-menetelmillä, voidaan paljastaa käyttämällä yksittäisten solujen RNA-seq-menetelmää näiden kliinisesti merkittävien solupopulaatioiden tutkimiseen. Esimerkkejä bulk-analyysin haittapuolista on runsaasti, ja solutyyppierojen erittely useimmissa, ellei kaikissa, näistä monimutkaisista biologisista järjestelmistä on kriittisen tärkeää, jotta voimme ymmärtää niiden osuutta erityisesti kehityksen aikana ja taudin etenemisessä.
Miten eristämme ja analysoimme yksittäisiä soluja?
10x Genomicsin yhden solun RNA-seq (scRNA-seq) -teknologia, Chromium™ Single Cell 3′ Solution, mahdollistaa transkriptomien analysoinnin solukohtaisesti käyttämällä mikrofluidista partitiointia yksittäisten solujen talteenottoon ja viivakoodattujen seuraavan sukupolven sekvensoinnin (NGS) cDNA-kirjastojen valmistamiseen. Yksittäiset solut, käänteistranskriptioreagenssit (RT-reagenssit), viivakoodattuja oligonukleotideja sisältävät Gel Beads -geelihelmet ja öljy yhdistetään mikrofluidikkosirulla muodostaen reaktiovesikkeleitä, joita kutsutaan Gel Beads in Emulsion -geelihelmiksi (GEM). GEM:t muodostetaan rinnakkain sirun mikrofluidisten kanavien sisällä, jolloin käyttäjä voi käsitellä 100-10 000 yksittäistä solua yhdellä 7 minuutin Chromium™ Instrument -ajolla. On tärkeää huomata, että solut ladataan rajoittavalla laimennoksella, jotta maksimoidaan yksittäistä solua sisältävien GEM:ien määrä, jotta varmistetaan alhainen dublettien määrä ja säilytetään samalla korkea, jopa ~65 %:n solujen talteenottoprosentti.
Jokainen toimiva GEM sisältää yksittäisen solun, yksittäisen geelipartikkelin ja RT-reagenssit. Jokaisessa GEM-reaktiovesikkelissä yksittäinen solu lysoidaan, Gel Bead liuotetaan identtisesti viivakoodattujen RT-oligonukleotidien vapauttamiseksi liuokseen ja polyadenyloituneen mRNA:n käänteinen transkriptio tapahtuu. Tämän seurauksena kaikilla yksittäisestä solusta peräisin olevilla cDNA:illa on sama viivakoodi, minkä ansiosta sekvensointilukemat voidaan yhdistää takaisin alkuperäisiin yksittäisiin soluihin. NGS-kirjastojen valmistaminen näistä viivakoodatuista cDNA:ista suoritetaan sitten erittäin tehokkaassa bulkkireaktiossa. Alla olevalla videolla on hyvä visuaalinen selitys siitä, miten tämä kaikki toimii.
Näytteen esikäsittelystä ohjevideoihin: Chromium Single Cell 3′-työnkulku alkaa kiinnostavista soluista, minkä jälkeen seuraa NGS-kirjaston rakentaminen reagenssipakkauksiemme ja Chromium Controller -ohjaimen avulla. Viivakoodatun cDNA-kirjaston valmistelu (kuten edellä olevassa videossa yleisesti kuvataan) on tärkeä vaihe, ja sanonnan ”garbage in, garbage out” (roskat sisään, roskat ulos) mukaisesti laadukkaan solususpensioiden valmistelu on avainasemassa, kun halutaan saada paras mahdollinen hyöty irti RNA-seq-datasta. Jos tarvitset apua solujen valmistuksessa, verkkosivuillamme on useita demonstroituja protokollia, kuten hermokudoksen dissosiaatio tai sammalprotoplastisuspensioiden valmistaminen scRNA-seq-menetelmää varten, ja tukisivuillemme lisätään säännöllisesti uusia protokollia. Jos haluat ohjeita ja suosituksia siitä, miten näytteesi voidaan parhaiten valmistella, kun ne ovat suspensiossa, hyvä lähtökohta on yksittäisten solujen valmisteluoppaamme, jossa voit oppia lisää parhaista käytännöistä ja tarkastella yleistä protokollaa. Jos olet enemmän visuaalisen oppimisen ystävä, how-to-videot, erityisesti luvut 4-7, auttavat sinua näytteen ja kirjaston valmisteluprosessin läpikäymisessä.
-
Single Cell Prep Guide
-
Demonstrated Protocols
-
How-versiot
-
.to-videot
-
Chromium™ Controller
-
User Guides
-
How-to-videot
-
Cell Ranger™ -ohjelmisto
-
Loupe™ Cell Browser
-
How-to-videot
Analysointi, yksi solu kerrallaan
Kirjastosi valmistamisen jälkeen sekvensointi suoritetaan Illumina®-sekvensointilaitteilla. Tämä johtaa hauskaan osaan: biologisten oivallusten keräämiseen yhden solun RNA-seq-datastasi! Chromium Single Cell 3′ Solution -ratkaisulla tuottamasi (mahdollisesti) valtava tietomäärä voidaan helposti käsitellä ohjelmisto- ja visualisointityökaluillamme, jotka on suunniteltu poistamaan suuri osa arvailusta – Cell Ranger™ -ohjelmisto muuntaa viivakoodatun sekvensointidatan tiedostoiksi, jotka ovat valmiita yksittäisten solujen ekspressioanalyysiä varten, ja visualisointi tapahtuu Loupe™ Cell Browser -ohjelmiston avulla. Jos haluat vaiheittaisen ohjeen ohjelmistojemme käytöstä, how-to-videomme luvuissa 8-11 käsitellään kaikkea transkriptien laskennasta Cell Ranger Software -ohjelmistolla kauniiseen datan visualisointiin Loupe Cell Browserilla. Yhteisössä on myös yhä enemmän yksittäisten solujen analysointityökaluja, kuten Seurat, Monocle ja Cell View. Lue lisää näistä analyysityökaluista ja muista yksisoluartikkeleista 10x Genomics -blogista, jossa tuomme esiin tärkeitä tutkimustuloksia, annamme vinkkejä ja temppuja ja pidämme sinut ajan tasalla kaikesta yksisoluasioista!
Jos sinulla on muita kysymyksiä tai huolenaiheita liittyen Chromium Single Cell 3′ Solution -ratkaisun käyttöönoton aloittamiseen, jätä rohkeasti kommentti tänne tai ota suoraan yhteyttä meihin. Olipa kyse sitten aivojen organoidien kehityksen seuraamisesta, luuydinsiirtojen tutkimisesta akuuttia myelooista leukemiaa sairastavilla potilailla tai suoliston kantasolujen itseuudistumisen uuden polun selvittämisestä, Chromium Single Cell -julkaisujen määrä kasvaa päivittäin, ja odotamme innolla, että saamme kuulla kaikista upeista tutkimuksistasi!