Tietoa
Mikrobeja on noin 10 000 nimettyä lajia. On arvioitu, että jokaista tunnistettua lajia kohti on 10 000-100 000 tunnistamatonta lajia enemmän. Sen lisäksi, että bakteerilajeja on monia, yksittäisiä bakteereita on paljon. Yhdessä lusikallisessa maaperää voi olla 100 miljoonaa yksittäistä bakteeria. Ikenistäsi kaapimalla voidaan saada 1 miljoona bakteeria neliösenttimetriä kohti (neliösenttimetri on noin pienen sormenkynnen kokoinen). Kehossamme ja kehossamme olevat bakteerit muodostavat noin 10 % ruumiin kuivapainostamme.
Suurin osa tällä hetkellä tunnetuista bakteerilajeista on tunnistettu perinteisillä mikrobiologisilla menetelmillä, kuten gramvärjäysreaktiolla, morfologialla ja aineenvaihduntareaktioilla. Bakteerit elävät harvoin yksin vaan yhteisöissä muiden bakteerien kanssa. Tämä pätee sekä ympäristössä että kehossamme ja kehossamme. Tällä kurssilla keskitytään bakteerien rooliin sairauksissa. Yksittäisen bakteerilajin eristäminen on ensimmäinen askel sairausprosessista mahdollisesti vastuussa olevien bakteerien tunnistamisessa.
Bakteerin fyysisen eristämisen ensimmäinen edellytys on, että sitä voidaan viljellä laboratoriossa. Tämä edellyttää tietoa kasvun kannalta optimaalisesta lämpötilasta, optimaalisista happivaatimuksista ja optimaalisista ravinnontarpeista. Työskentelemme tällä kurssilla hyvin rajoitetun määrän bakteerien kanssa. Bakteerit, joiden kanssa työskentelemme, ovat myös hyvin helppoja viljellä laboratoriossa. Useimmat bakteerit eivät ole näin miellyttäviä!
Organismien eristämiseen on kaksi päätapaa.
- Eristäminen agarlevylle eristämistä varten
- Valauslevymenetelmä
Eristäminen agarlevylle eristämistä varten tarkoittaa organismien peräkkäistä laimennusta, kunnes solut ovat riittävän pienellä tiheydellä niin pienellä tiheydellä, että yksittäiset solut ovat fysikaalisesti ja alueellisesti erillään niin, että ne saavat aikaan tunnistettavissa olevia yksilöllisiä pesäkkeitä. Kaatolevymenetelmässä näyte laimennetaan riittävästi ennen kuin se lisätään sulaan jäähdytettyyn agariin ja kaadetaan sitten seos lautaselle. Eristetyt solut muodostavat yksittäisiä pesäkkeitä, jotka kasvavat itse agarissa. Tämä tekniikka voi olla hieman hankala. Jos sulatettu agar on liian kuumaa, kaikki bakteerit kuolevat. Jos sulatettu agar on liian kylmää, Petri-maljaan jää iso möhkäle. Raidoitusmenetelmällä saadaan yksittäisiä pesäkkeitä agarin pinnalle. Tämä tekniikka on paljon nopeampi ja helpompi hallita.
Yleiskatsaus
Sinulle annetaan lieminäyte, joka sisältää kolme organismia, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens ja Escherichia. coli.
Kaikki kolme organismia kasvavat helposti aerobisesti tryptisellä soija-agarilla (TSA). S. marsescens muodostaa kuitenkin punaista pigmenttiä vain enintään 35 °C:ssa ja optimaalisesti huoneenlämmössä (25 °C). Se kasvaa erittäin nopeasti kaikissa lämpötiloissa keskikokoisiksi pesäkkeiksi.
E. coli näyttää ruskealta kaikissa lämpötiloissa, ja se kasvaa myös nopeasti ja muodostaa suuria pesäkkeitä.
S. xylosus näyttää kelta-oranssilta kaikissa lämpötiloissa, kasvaa nopeasti ja muodostaa keskikokoisia tai suuria pesäkkeitä.
Kykeneväsi eristämään ja näkemään levylläsi olevat kolme organismia on riippuvainen sopivista inkubaatio-oloista. Levyjäsi inkuboidaan huoneenlämmössä 48 tuntia. Sinun pitäisi pystyä tunnistamaan kolme organismia pesäkkeiden koon ja pigmentin perusteella.
Materiaalit
- 1 sekaviljelmä tryptisen soijaliemen (TSB) putkessa, joka sisältää Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens ja Escherichia. Coli (kaikki BSL2)
- 3 TSA-levyä
Ripustaminen eristysmenetelmää varten
Ripustamiseen on useita menetelmiä. Valtaosa opiskelijoistamme on onnistunut parhaiten neliömenetelmällä, joka on kuvattu alla.
- Merkitse levyllesi nimesi, päivämääräsi, jaksosi ja organismisi.
- Käytä BSL2-menetelmiä saadaksesi silmukkatäytteisen määrän organismeja tryptisen soijaliemen (TSB) putkesta. Katso aseptisen tekniikan protokolla.
- Varmista, että olet sekoittanut liemiputken riittävästi, jotta organismit suspendoituvat liemeen tasaisesti.
- Kaada TSB-putki uudelleen.
- Voit tehdä seuraavan osan lautasesi laboratoriopöydällä tai pitämällä sitä kädessäsi. Sinä päätät, kumpi toimii parhaiten. Vedä silmukkaa kevyesti edestakaisin agarin pinnalla. (Katso kuva 1.)
- Mitä enemmän vedät, sitä enemmän bakteereja laskeutuu.
- Yleinen ajatus on vähentää bakteeripitoisuutta jokaisella pyyhkäisyllä.
- Neljästä viiteen siksakkia näyttää toimivan hyvin.
- Kokeile eri levyilläsi. Muista pitää kirjaa siitä, mitä teit kullakin levyllä.
- Jos käytät polttolaitetta, steriloi silmukka. Jos käytät muovisilmukoita, hävitä käytetty silmukkasi ontelosilmukka-astiaan ja hanki uusi steriili muovisilmukka.
- Älä palaa takaisin alkuperäiseen liemiputkeen.
- Kosketa silmukkaa agar-pinnalla ensimmäisen juovasi kauimmaista päätä vasten. Toista vetämällä edestakaisin.
- o Älä vedä levyn keskelle.
- o Sinun pitäisi pystyä näkemään raitajälkesi heikot painaumat agar-pinnalla.
- Käyttämällä steriiliä silmukkaa toista toimenpide toiselle raidallesi.
- Käyttämällä steriiliä silmukkaa toista toimenpide kolmannelle raidallesi. Tee viimeinen osa siksakilla levyn keskelle.
- Pitäisi päästä eristettyihin pesäkkeisiin jossain päin viimeistä raitaa.
- Jos käytät polttolaitetta, steriloi silmukka. Jos käytät muovisilmukoita, hävitä käytetty silmukkasi kavitsemisastiaan.
- Asenna kansi takaisin levyllesi.
- Asenna valmiit levyt agar-puoli ylöspäin inkubointitelineeseen etupöydän etupuolella inkubointiosastolla.
Kuvio 1. Asenna levyt takaisin: Nelikenttämenetelmä raidoittamiseen eristämistä varten.
Huomautuksia
- On ehdottoman tärkeää, että steriloit silmukan jokaisen raidoittamisen välillä joko käyttämällä polttolaitetta tai hankkimalla uuden steriilin muovisilmukan. Tämä on yleisin virhe, jonka opiskelijat tekevät.
- Älä jätä levyäsi auki liian pitkäksi aikaa, sillä muuten ympäristöstä putoaa ylimääräisiä bakteereja levyllesi.
- Älä pety, jos et saa eristettyjä pesäkkeitä ensimmäisellä yritykselläsi. Tämä on vaikea toimenpide.