Single-domain-vasta-aineet eli nanokehot ovat hiljattain nousseet valokeilaan COVID-19:n mahdollisena hoitomuotona. Itse asiassa australialaisen bioteknologiayrityksen Beroni Groupin kehittämä COVID-19:n nanovasta-aineisiin perustuva hoito on parhaillaan prekliinisissä testeissä. Vaikka nanokehojen terapeuttinen potentiaali on vasta alkanut realisoitua, niitä on tutkittu jo vuosikymmeniä.
Vuonna 1989 kaksi jatko-opiskelijaa Vrije Universiteit Brusselissa löysi sattumalta kamelieläinten (muun muassa kamelien, laamojen ja alpakoiden) ainutlaatuisen ominaisuuden. Tutkiessaan pakastettua kamelin veriseerumia opiskelijat havaitsivat, että kamelieläimet eivät tuota ainoastaan tavanomaisia vasta-aineita vaan myös ainutlaatuisen sekundaarisen yhden ketjun vasta-aineita (scAbs), jotka koostuvat kahdesta identtisestä raskaanketjuisesta polypeptidistä, joista kumpikin sisältää kaksi vierekkäistä pysyvää domeenia, sarana-alueen ja muuttuvan domeenin. (Kummankin raskaan ketjun pysyvät domeenit kulkevat yhdensuuntaisesti; sarana-alueen jälkeen muuttuvat domeenit eroavat toisistaan kuin Y-kirjaimen varret.) Kumpikin scAb:n muuttuvista domeeneista toimii antigeeniä sitovana moduulina.
Tämä jännittävä löytö oli vasta alkua. Myöhemmät työt paljastivat, että antigeenin tunnistamiseen tarvitaan vain pieni osa scAb:stä, yksi ainoa muuttuva domeeni. Tämä fragmentti painaa vain 12-15 kDa, mistä nimitys ”nanovasta-aine”.
Henkilön vasta-aineet sen sijaan koostuvat kahdesta identtisestä raskaan ketjun ja kahdesta identtisestä kevyen ketjun polypeptidistä. Nämä proteiinit ovat suuria, ja niiden molekyylipaino on noin 150 kDa. Toisin kuin kamelidien scAb:t, ihmisen vasta-aineiden antigeenin sitoutumiskohta ulottuu sekä raskaaseen että kevyeen ketjuun (tai pikemminkin näiden ketjujen muuttuviin domeeneihin), mikä tarkoittaa, että kaikkia ketjuja tarvitaan antigeenin havaitsemiseen.
Nanobodyn edut
Koska ihmisen vasta-aineet ovat isoja, niillä on usein vaikeuksia päästä pieniin sitoutumispaikkoihin viruksissa, tietyissä soluissa ja syvällä kasvainkudoksessa oleviin kohteisiin. Pienet nanokappaleet pystyvät kuitenkin liikkumaan ahtaissa tiloissa, ja ne voivat olla houkutteleva vaihtoehto ihmisen vasta-aineille terapeuttisten kehittäjien kannalta. Lisäksi nanokappaleiden sitoutumisalue on pitkä, mikä tuottaa ”sormimaisen” rakenteen, joka parantaa nanokappaleiden kykyä saavuttaa kohteensa.
Yksi nanokappaleiden valtavaksi eduksi perinteisiin ihmisen vasta-aineisiin verrattuna on niiden helppo valmistettavuus. Suhteellisen yksinkertainen prosessi aloitetaan immunisoimalla kamelidi halutulla antigeenillä. Kamelidin immuunijärjestelmä tuottaa scAb:tä, joka tunnistaa antigeenin. Tämän jälkeen kamelidilta otetaan verinäyte (joka jätetään muuten vahingoittumattomaksi), ja näytteestä uutetaan scAb:n mRNA.
Vaihtelevan antigeeniä sitovan domeenin eli nanovasta-aineen geenit monistetaan sitten mRNA:sta. Lopullista nanovartaloa voidaan sitten tuottaa suuria määriä mikro-organismien, tyypillisesti Escherichia coli -bakteerin, sisällä edullisesti.
Uudemmat menetelmät poistavat eläimet kokonaan yhtälöstä testaamalla antigeenejä ennalta tuotettua nanovartalokirjastoa vastaan. Twist Bioscience tarjoaa Twist BioPharma -divisioonansa kautta erityyppisiä nanobody-kirjastoja laama scAb-kehyksessä tai osittain humanisoidussa scAb-kehyksessä. Miljardeja nanobody-sekvenssejä voidaan testata kerralla, mikä tekee vasta-aineiden keksimisestä ja kehittämisestä erittäin nopeaa ja suhteellisen edullista.
Nanobody-sovellukset
Alun perin nanokehiä käytettiin vain tai pääasiassa tutkimustarkoituksiin. Tutkimus nanokappaleiden käytöstä terapeuttisena aineena on kuitenkin lisääntynyt dramaattisesti viime vuosikymmenen aikana. Helmikuussa 2019 saavutettiin merkittävä edistysaskel, kun FDA hyväksyi ensimmäisen nanokeholääkkeen.
Lääkkeen, nimeltään Cablivi, kehitti Ablynx hankitun tromboottisen trombosytopenisen purppuran hoitoon. Cablivi toimii anti-von Williebrand-tekijänä ja estää verihiutaleita kerääntymästä elinten ympärille.
Nanokehot erilaisiin sairauksiin ovat kliinisissä tutkimuksissa. Nanokehoja arvioidaan esimerkiksi psoriaasin, nivelreuman ja virusinfektioiden hoidoksi.
Nanokehot voivat olla yksittäisiä hoitomuotoja, mutta myös yhdistelmähoitoja. Kiinnostavia ovat kliiniset tutkimukset, joissa tutkitaan nanokehojen ja kimeerisen antigeenireseptorin (CAR, chimeric antigen receptor) T-soluhoitojen yhdistelmää syövän hoidossa.
CAR T-solut ovat geneettisesti muokattuja tunnistamaan ja kohdistamaan antigeenejä kasvainten pinnalla. Tähän mennessä CAR-T-soluhoidot ovat olleet erittäin lupaavia hoitoja verisyöpiin, jotka eivät reagoi tavanomaisempiin hoitoihin. CAR-T-soluhoidot eivät kuitenkaan ole vielä menestyneet kiinteitä kasvaimia vastaan.
Voidakseen torjua kiinteitä kasvaimia CAR-T-solujen on ehkä kohdistettava toimintansa vaihtoehtoisiin kohteisiin. Tavanomaisia kohteita ovat syöpäspesifiset antigeenit, joita on osoittautunut vaikeaksi löytää, ja syöpään liittyvät antigeenit, jotka ovat helpommin löydettävissä, mutta joihin on vaikeampi puuttua turvallisesti, koska niitä esiintyy myös terveissä soluissa.
Nämä kohteet aiheuttavat vielä yhden toisenkin vaikeuden. Niihin kohdistetaan yleensä CAR-T-soluja, jotka sisältävät ihmisen monoklonaalisesta vasta-aineesta peräisin olevan antigeenin tunnistavan domeenin. Ihmisen vasta-aineet voivat kuitenkin aiheuttaa immunogeenisuutta, mikä johtaa sivuvaikutuksiin ja CAR T-solujen tehon heikkenemiseen.
Mitkä vaihtoehtoiset kohteet voisivat olla sopivia? Mahdollisuuksia on runsaasti solunulkoisessa matriisissa, joka on proteiinien verkosto, joka suojaa kiinteitä kasvaimia ja sisältää immunosuppressiivisia molekyylejä. Ajatus solunulkoisessa matriisissa oleviin kohteisiin kohdistamisesta kiinnosti Bostonin lastensairaalan tutkijoita. Lopulta nämä tutkijat päättivät kehittää CAR T-soluja, joissa on nanokehoista peräisin olevia antigeenit tunnistavia domeeneja.
Tutkijat osoittivat hiirimäisten syöpämallien avulla, että nanokehoihin perustuvat CAR T-solut ovat vain heikosti immunogeenisia ja kykenevät tunnistamaan tiettyjä antigeenejä kasvaimen mikroympäristössä. Näiden CAR T-solujen rakentamiseen tutkijat käyttivät Gibsonin assosiointimenetelmää, tekniikkaa, jonka avulla voidaan yhdistää ja kloonata useita DNA-fragmentteja.
CAR T-solujen nanobody-konstruktiot kykenevät vahingoittamaan kasvaimia ravitsevia verisuonia ja kasvaimia suojaavia solunulkoisen matriisin osia. Kasvaimen mikroympäristön vaurioituminen hidastaa merkittävästi kasvua ja mahdollistaa muiden hoitojen, kuten solunsalpaajahoidon, pääsyn kasvaimen sisälle.
Nanobodyjen kehityskysymykset
Nanobody-hoitoaineen markkinoille tulo kesti 30 vuotta sen jälkeen, kun nanokehotteet löydettiin vuonna 1989. Ensimmäiset 10 vuotta keskityttiin nanokappaleiden rakenteen, koostumuksen ja ominaisuuksien tutkimiseen. Heti 10 vuoden jälkeen, vuonna 2001, Vrije Universiteit Brussel yritti kaupallistaa nanokehoja, ja sen nimissä myönnettiin useita patentteja. Nämä patentit siirtyivät myöhemmin Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie (VIB) -laitokselle ja sitten VIB:n perustamalle Ablynx-yhtiölle vuonna 2002.
On todennäköistä, että nanokappaleiden koostumusta koskevat teollis- ja tekijänoikeudelliset rajoitukset vaikuttivat osaltaan siihen, että nanokappaleiden keksimisen ja ensimmäisen nanokehopohjaisen lääkkeen hyväksymisen välillä oli pitkä viive. Tämän biomolekyylin tärkeimmät patenttivaatimukset päättyivät kuitenkin vuonna 2014 Euroopassa ja vuonna 2017 Amerikassa, minkä ansiosta Ablynx pystyi laajentamaan merkittävästi yhteistyötään joidenkin maailman suurimpien lääkeyhtiöiden, kuten Merck & Co:n, Boehringer Ingelheimin ja Sanofin, kanssa.
Tämän yhteistyön tuloksena rekisteröitiin runsaasti kliinisiä tutkimuksia, joissa käytettiin nanokeholääkkeitä, ja saatiin Cablivin kauan odotettu hyväksyntä. Lisäksi nanokappaleiden koostumukseen liittyvien teollis- ja tekijänoikeudellisten esteiden väheneminen on mahdollistanut sen, että entistä useammat yritykset ovat osoittaneet kiinnostusta näiden supermolekyylien kaupallistamisen jatkamiseen.
Kuten kaikissa hoitomuodoissa, myös nanokappaleissa on haittoja. Niiden pieni koko johtaa nopeaan puhdistumiseen munuaisten kautta, mikä lyhentää niiden puoliintumisaikaa. Siksi riittävän suuren määrän nanokappaleita veressä halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi tarvitaan usein annostelua, mikä voi aiheuttaa munuaistoksisuutta. On myös pieni riski, että potilaat voivat saada immuunivasteen terapeuttisille nanokappaleille, koska ne ovat biologista materiaalia.
Onneksi nämä ongelmat voidaan ratkaista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että nanokappaleiden sulauttaminen seerumin albumiiniin, joka on veressä runsaasti esiintyvä kuljetusproteiini, pidentää merkittävästi nanokappaleiden puoliintumisaikaa, jolloin ne pysyvät veressä pidempään ja suurempina määrinä. Nanokappaleiden immunogeenisuutta voidaan vähentää humanisoimalla, mikä on prosessi, jossa joitakin nanokappaleiden proteiinisekvenssejä muokataan siten, että niiden samankaltaisuus ihmisen vasta-aineiden kanssa lisääntyy, mikä vähentää negatiivisen immuunireaktion riskiä.
Vaikka nanokappaleiden kaupallistaminen terapeuttisina lääkkeinä on viivästynyt, nyt kun useat yhtiöt pystyvät sijoittamaan näihin upeisiin ja ainutlaatuisiin molekyyleihin, nanokappaleiden käyttö terapeuttisina lääkkeinä moniin sairauksiin virusinfektioista syöpään odotetaan räjähdysmäisesti lisääntyvän pian. Camelid-nanokehot eivät ole ainoastaan osoittaneet arvonsa, vaan ne voivat myös muuttaa vasta-ainehoidon maisemaa ja tuoda mukanaan uuden sukupolven terapeuttisia aineita.