Taulukko 1
Exkitaatio, emissio ja kirkkaus
Jos aiot käyttää useita fluoresoivia tunnisteita, on tärkeää valita sellainen tunniste, jolla on selvät emissiohuiput – sekä eksitaatiohuiput, jotka pystyt kohdentamaan käytettävissä olevilla lasereilla. Jos emissiohuiput menevät päällekkäin, niiden erottaminen toisistaan on vaikeaa tai mahdollisesti mahdotonta.
Tyypillisesti haluat kirkkaimman fluoresoivan tunnisteen käytettävissäsi olevasta spektristä, jotta saat selvän signaalin ja voitat mahdollisen taustafluoresenssin. Kirkkausarvot ovat proteiinin ekstinktiokertoimen ja kvanttituoton tulo. Tuloksena saatavaa lukua voi kuitenkin olla vaikea tulkita, joten fluoresoivan tunnisteen kirkkaus suhteessa hyvin määriteltyyn tunnisteeseen, kuten EGFP:hen, on yleinen vaihtoehtoinen mittari.
Kypsyminen ja valkaisu
Kypsyminen määrittelee, kuinka kauan fluoresoivalta tunnisteelta kestää taittua kunnolla, muodostaa kromoforin ja alkaa fluoresoida. Lyhyt kypsymisaika voi olla tärkeä elävissä soluissa tapahtuville ajallisesti herkille tapahtumille. Esimerkiksi superfolder GFP (sfGFP) voi taittua alle 10 minuutissa, kun taas mOrange voi kestää yli neljä tuntia.
Värjäytyminen mittaa fotostabiilisuutta eli sitä, kuinka kauan herätyksen jälkeen kromofori menettää kykynsä emittoida valoa. Jos aiot tehdä pitkiä time-lapse-kokeita, harkitse merkkiä, jonka fotostabiilisuus on korkea. Riippuen ympäristöstä, jota aiot käyttää, saatat joutua joko säätämään olosuhteita hieman tai valitsemaan sopivamman tagin.
PH voi vaikuttaa heräte- ja emissiohuippuihin, ja suurin osa fluoresoivista tageista on herkkiä hapoille: jotkut voivat jopa muuttaa fluoresenssin voimakkuutta pH:n muuttuessa (esim. pHTomato). PKa-arvo on hyvä indikaattori pH-herkkyydestä, sillä se osoittaa pH:n, jossa puolet kromoforeista fluoresoi.
Lämpötila ja happipitoisuus vaikuttavat molemmat kypsymisajoihin: hypoksiset olosuhteet yleensä viivästyttävät kypsymisaikoja, samoin kuin fluoresoivan tunnisteen optimaalisen alueen ulkopuoliset lämpötilat (esim. EGFP on optimoitu toimimaan 37 °C:ssa). Uudemmat fluoresoivat tunnisteet, kuten UnaG, japanilaisesta makeanveden ankeriaasta (Anguilla japonica) eristetty GFP, fluoresoi kuitenkin myös silloin, kun happipitoisuus on alhainen3.
Kodonien optimointi
Koska useimmat fluoresoivista tunnisteista on johdettu meduusojen tai korallien proteiineista eikä jostain nisäkässoluista ja -kudoksista, joissa niitä todennäköisesti käytetään, käytetyissä aminohappokodoneissa voi olla lajien välisiä eroja. Tämä voi johtaa huonoon ilmentymiseen ja siten heikkoon signaaliin.
Suurimmaksi onneksi monet fluoresoivien tunnisteiden uudemmat versiot on optimoitu koodonien suhteen nisäkässolujen mieltymysten mukaisiksi. Esimerkiksi GFP:n osalta Jürgen Haas ja kollegat paransivat signaalia 40-120-kertaiseksi muokkaamalla GFP:n koodonisekvenssiä4.
Jos käytät vanhempaa plasmidia fuusioproteiiniesi tuottamiseen, se ei välttämättä sisällä muokattua fluoresoivaa tagisekvenssiä. Tarkista siksi aina, onko sekvenssi muokattu käytettäväksi tietyssä lajissa.
Oligomerisaatio
On tärkeää määrittää, onko tunnisteesi monomeeri vai dimeeri (monomeerit merkitään tavallisesti ”m”-merkillä proteiinin nimen edessä, esim. mCherry), ja vaikuttaako tämä kokeeseesi. Monet varhaisista fluoresoivista tunnisteista olivat alttiita muodostamaan oligomeerejä, ja oligomerisaatio voi vaikuttaa fuusioproteiinin biologiseen toimintaan. Esimerkiksi EGFP on monomeeri, joka voi muodostaa dimeerejä, kun sitä käytetään riittävän suurina pitoisuuksina, mikä voi vääristää solunalaisia organelleja5 tai häiritä FRET6:n kaltaisia kokeita. Todella monomeeriset FP:t ovat suositeltavia useimmissa tapauksissa.
GFP- ja mCherry-tuotteet