Instrumentti ja reagenssit
Metotreksaattimäärityksen MTX:n havaitsemislaitteena käytettiin Siemensin VIVA-E-laitetta, joka mahdollistaa parametrien räätälöinnin avoimen kanavan ansiosta. MTX-reagenssit ja kalibraattorit ostettiin Siemensiltä (6L119UL).
Kolme tasoa laadunvalvontamateriaalia (QC-materiaalia) ostettiin Bio-Radilta (Irvine, CA), ylimääräinen räätälöity QC-materiaali, jonka taso oli 0,05 μmol/L, Aladdinilta (Shanghai, Kiina).
MTX-menetelmän vertailu suoritettiin analysoimalla samat näytteet nestekromatografia-tandem-massaspektrometriamäärityksellä (LC-MS/MS) (nestekromatografia LC-20 AD ja AB SCIEX QTRAP®4500 -massaspektrometrit).
Näytteet
Testinäytteet saatiin Dalianin lastensairaalan hematologiselta osastolta. Joitakin testattuja näytteitä ja MTX-vapaita ikterisiä plasmanäytteitä kerättiin triglyseridi- ja bilirubiinihäiriöiden tutkimista varten. Potilaiden hoitoon ei puututtu, eikä potilaan yksilöllisiä tietoja mainittu.
Reagenssien valmistelu
Siemensin reagenssipakkaus sisältää vasta-aine/substraattireagenssi A:n, entsyymireagenssi B:n, Emit-lääkemäärityspuskurikonsentraatin ja Emit-metotreksaattikalibraattorit. Reagenssit A ja B rekonstruoitiin 3,0 ml:aan deionisoitua vettä, sekoitettiin varovasti pyörittämällä ja tasapainotettiin huoneenlämmössä 1 h. MTX-puskurikonsentraatti sekoitettiin deionisoituun veteen (1:15 v/v). Reagenssien A ja B käyttöliuos valmistettiin laimentamalla kantaliuokset 1:9 v/v puskuriliuoksella.
Joitakin kalibraattoreita (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/l) palautettiin ilmoitettuun konsentraatioon 1.0 ml deionisoitua vettä valmistajan ohjeiden mukaisesti, muut kalibraattorit 1,50 ja 2,00 μmol/L rekonstruoitiin 1,00 μmol/L:ksi vastaavasti 1,50 ja 2,00 ml:lla deionisoitua vettä. Sitten 0,20 μmol/l kalibraattori laimennettiin 0,05 μmol/l:ksi ja 1,00 μmol/l laimennettiin 0,10 ja 0,25 μmol/l:ksi. Uusi joukko kalibraattoreita (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 ja 1,00 μmol/L) täyttää modifioidun kalibraattorikäyrän vaatimukset.
Viva-E-laitteen ohjelmointi
Viva-E:n avoin kanava ohjelmoitiin muuttamaan reagenssien A & B tilavuudet 180 μl:stä 110 μl:iin (110 μl:n tilavuuden alaraja Viva-E:ssä MTX-reagensseille). Kuuden pisteen kalibrointikäyrä ohjelmoitiin modifioidulla kuutiomaisella spline-regressiolla. Kitin kuusi kalibraattoria olivat 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 ja 2,00 μmol/l. Kun reagenssien A ja B tilavuuksia pienennettiin, ne eivät riittäneet reagoimaan yli 1 μmol/l näytteisiin. Tämän seurauksena modifioidun EMIT-määrityksen uusi kalibraattorisarja muutettiin muotoon 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/l välillä 0,05-1,00 μmol/l.
Kaupallisen kitin ohjeen mukaan näytteet, joiden konsentraatio on yli 1,00 μmol/l, olisi laimennettava kalibrointikäyrän alueelle (0.05-1,00 μmol/L) käyttäen laimennuskerrointa 10, 100 tai 1000.
Tyhjäkäyntiraja, toteamisraja, määritysraja
Tyhjäkäyntiraja (LOB), toteamisraja (LOD), määritysraja (LOQ) määritettiin CLSI EP17-A -standardin mukaisesti. LOB määritettiin käyttäen kuutta näytettä (S1-S6, 10 toistoa 10 päivän aikana): S1 ja S2 olivat nollakalibraattoreita kahdesta eri kalibraattorierästä, S3 ja S4 olivat laimennusainetta, S5 ja S6 olivat nollaplasmaa. LOD määritettiin viidellä matalan tason näytepoolista, jotka vaihtelivat LOB:stä nelinkertaiseen LOB:hen (12 toistoa 12 päivän aikana). LOB ja LOD määritettiin kahdella reagenssierällä. Kliinisten vaatimusten mukaisesti kokonaisvirheen tavoitteeksi asetettiin 20 %. LOD-tutkimuksen testituloksia käytettiin arvioimaan harhaa ja epätarkkuutta kunkin analyyttitason osalta. Sitten nämä tiedot yhdistettiin kokonaisvirheen arvioimiseksi kullakin tasolla ja määritysrajan (LOQ) määrittämiseksi.
Päivänsisäinen ja päivänsisäinen epätarkkuus
Modifioidun määrityksen päivänsisäinen (n = 10) epätarkkuus arvioitiin yhdellä vertailumateriaalien tasolla (0,05 μmol/l) ja kolmella potilasnäytteiden tasolla (0,12, 0,43, 0,82 μmol/l). Kullakin tasolla tehtiin 10 toistoa. Päivien välinen (n = 25) epätarkkuus testattiin näillä neljällä tasolla viitenä peräkkäisenä päivänä ja 5 toistoa kullakin tasolla. Kaikki näytteet saatiin eri potilailta. Mitatut tulokset piirrettiin odotettuja arvoja vastaan.
Lineaarisuus
Lineaarisuus tarkistettiin laimentamalla laatukontrolli 2,00 μmol/l (hc) puskurilla (c0) seuraavilla suhteilla: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Jokainen laimennus analysoitiin kolme kertaa, modifioidun määrityksen lineaarisuusyhtälö laskettiin mitattujen tulosten ja odotettujen arvojen keskiarvojen perusteella.
LC-MS/MS-määritysmenettely
Tässä tutkimuksessa suoritettu LC-MS/MS-määritys on seuraava. Sisäisenä standardina käytettiin difenhydramiinia. Seerumin saostusaineena käytettiin asetonitriiliä albumiinin poistamiseksi. LC-erotuksissa käytettiin Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) -kolonnia. Liikkuva faasi oli 0,1 % muurahaishappoa ja asetonitriiliä. Gradienttieluutio suoritettiin virtausnopeudella 0,5 ml/min 30 °C:ssa. MTX:n ja difenhydramiinin havaitsemiseen käytettiin monireaktiomonitorointitilaa (MRM) sähkösuihkuionisaatiolähteessä (ESI) ja positiivisen ionin skannaustilassa. MTX havaittiin m/z 455.0 → 308.1, difenhydramiini havaittiin m/z 256.0 → 167.0.
Menetelmän vertailu
Seitsemänkymmentäyhdeksän näytettä kerättiin akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavilta potilailta Dalianin lastensairaalan hematologiselta osastolta. Jokainen näyte testattiin käyttäen muunnettua EMIT-määritystä ja LC-MS/MS-määritystä. Tuloksia verrattiin käyttämällä yksinkertaista lineaarista regressioanalyysiä (MedCalc Statistical Software versio 15.6.1). Menetelmän vertailua varten testattiin vielä 45 näytettä käyttäen muunnettua EMIT-määritystä ja kaupallista EMIT-määritystä.
Interferenssitutkimukset
Triglyseridien interferenssiä arvioitiin valmistamalla näytteet Intralipidillä (20 %:n IV-rasvaemulsio). Näytteiden triglyseridipitoisuus oli 1000 ng/dl. Sen jälkeen suoritettiin Paired-T-testi.
Bilirubiini-interferenssiä simuloitiin käyttämällä joitakin MTX:stä vapaita ikterisiä plasmanäytteitä, joiden bilirubiinipitoisuus oli vähintään 30 mg/dl.
Rakenteellisesti sukulaismetaboliitin 7-hydroksi-metotreksaatin aiheuttamaa interferenssiä arvioitiin lisäämällä plasmanäytteisiin eri pitoisuuksia 7-hydroksi-metotreksaattia, MTX:n pitoisuus näissä näytteissä oli 0,05 μmoL/L. Ja nykyisten näytteiden testituloksia verrattiin alkuperäisten näytteiden tuloksiin .