Tämän hemagglutinaation inhibitiomäärityksen yleistavoitteena on mitata vasta-ainetitterit kiinnostuksen kohteena olevia tiettyjä viruksia vastaan. Menetelmä voi auttaa vastaamaan rokotekologian alan keskeisiin kysymyksiin, jotka koskevat rokotevälitteistä immuniteettia ja suojaa eri väestöryhmissä ja eri ikä- ja potilasryhmissä. Menetelmän tärkeimpiä etuja ovat sen tarkkuus ja se, että sen avulla voidaan nopeasti määrittää neutraloivien vasta-aineiden tiitterit.
Vaikka tällä menetelmällä voidaan saada tietoa ihmisen vasta-ainetittereistä, sitä voidaan soveltaa myös muihin järjestelmiin, kuten hiirten seerumin vasta-ainetittereihin ja myös viljelmien supernatantteihin. Aloita merkitsemällä 96-kuoppaiset mikrotiterilevyt asianmukaisilla kokeellisilla tiedoilla. Käännä sitten levy pystyasentoon ja lisää monikanavapipetillä 25 mikrolitraa PBS:ää jokaiseen kuoppaan, paitsi alimman takatiitteririvin ensimmäiseen kuoppaan.
Lisää 50 mikrolitraa juuri valmistettua kiinnostavaa antigeeniliuosta takatiitteririvin ensimmäiseen kuoppaan ja sen jälkeen 25 mikrolitraa RDE-käsiteltyä seeruminäytettä kymmenen ylimmän rivin ensimmäisiin kuoppiin. Lisätään 25 mikrolitraa sopivaa antiseerumia 11. rivin ensimmäiseen kuoppaan positiivisena kontrollina. Siirretään 25 mikrolitraa kunkin rivin ensimmäisestä kuopasta peräkkäisiin kuoppiin kahdenkertaisten sarjalaimennusten suorittamiseksi.
Pipetoidaan ylös- ja alaspäin 10-15 kertaa kutakin laimennusvaihetta kohden ja hylätään viimeiset 25 mikrolitraa viimeisistä kuopista. Lisää seuraavaksi 25 mikrolitraa antigeeniliuosta rivien 1-11 kuoppiin ja 25 mikrolitraa pelkkää PBS:ää takatiitteririvin kuoppiin. Napauta levyä varovasti 10 kertaa kaikilla neljällä sivulla sekoittamiseksi.
Peitä levy sitten 30 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Lisää inkubaation lopussa 50 mikrolitraa punasoluliuosta kuhunkin kuoppaan ja sekoita levy uudelleen naputtelemalla. Peitä levy sitten uudelleen ja inkuboi punasoluja käytetyn lajin mukaisesti taulukossa esitetyllä tavalla.
Kun punasolut on lisätty levyyn, noudata määrityksessä käytetylle verilajille sopivaa inkubaatioaikaa. Liian lyhyt tai liian pitkä inkubaatio johtaa tulosten virheelliseen tulkintaan. Inkubaation päätyttyä arvioidaan hemagglutinaatio kallistamalla levyä 90 astetta 25 sekunnin ajan ja merkitään kunkin kuopan tulokset 96 kuoppalevyn tulostettuun kaavioon levyn ollessa edelleen kallistettuna.
Tässä kokeessa arvioitiin rokotteen aiheuttamaa vasta-ainevastetta 26 terveellä vapaaehtoisella, jotka saivat inaktivoidun, kolmiarvoisen influenssarokotteen, joka sisälsi influenssaa A/H1N1/Kalifornia/2009, A/H3N2/Texas/2012 ja B/Massachusetts/O2/2012 sisältävää inaktivoitua influenssarokotetta ennen influenssakautta 24 2015. Ristireaktiivinen immuunivaste A/H3N2/Sveitsi/2013- ja A/H3N2/Texas/2012-viruskannoille havaittiin, ja geometriset keskimääräiset hemagglutinaation estotitterit olivat huomattavasti alhaisemmat ja indusoitunut seroprotektio influenssaa A/H3N2/Sveitsi/2013 vastaan oli alhaisempi kuin influenssaa A/H3N2/Texas/2012 vastaan. Rokotuksen jälkeen vasta-ainetitterit molempia kantoja vastaan nousivat, vaikka A/H3N2/Sveitsi/2013-kantaa ei ollut rokotteessa.
Viruksen hemagglutiniini osoittaa lajista riippuvaa potentiaalia erytrosyyttien hemagglutinaatioon. Mielenkiintoista on, että marsun veri ei hemagglutinoidu kunnolla influenssa B:n kanssa ja kalkkunan verellä on potentiaalia hemagglutinaatioon korkeilla tittereillä ja vähäisellä ristireaktiivisuudella. Kun tämä tekniikka on hallussa, se voidaan suorittaa kolmessa tunnissa, jos se suoritetaan oikein.
Tätä menetelmää yrittäessä on tärkeää muistaa seerumi RDE:llä inaktivoida kaikki epäspesifiset inhibiittorit ja epäspesifinen sitoutuminen viruksen hemagglutinaation aikana. Tämän menettelyn jälkeen voidaan suorittaa muita menetelmiä, kuten ELISA, jotta voidaan vastata lisäkysymyksiin yksittäisten patogeenispesifisten immunoglobuliinien roolista. Kehityksensä jälkeen tämä tekniikka tasoitti tietä virusimmunologian alan tutkijoille, jotta he pystyivät syventämään ymmärrystämme rokotteeseen liittyvästä immuniteetista terveillä ja immunosuppressoituneilla potilailla eri ikäryhmissä.
Katsottuasi tämän videon sinulla pitäisi olla hyvä käsitys siitä, miten hemagglutinaation inhibitiomääritys suoritetaan influenssakantaspesifisten vasta-ainetitterien kvantifioimiseksi suuressa mittakaavassa. Älä unohda, että työskentely virusantigeenien, eläinten veren ja ihmisten seeruminäytteiden kanssa voi olla erittäin vaarallista ja että varotoimenpiteet, kuten työskentely BSL2-laboratoriossa, olisi aina toteutettava tätä toimenpidettä suoritettaessa.