RNaasi A: Usein kysytyt kysymykset | AG Scientific Blog

Esittely RNaasiin

Ribonukleaasit (RNaasit) ovat suuri ryhmä hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat ribonukleiinihappomolekyylejä (RNA). Ne ovat nukleaaseja, jotka katalysoivat RNA:n hajoamista pienemmiksi komponenteiksi. Ne ovat RNA:n hajoamista katalysoivien entsyymien superperhe, joka toimii transkription ja translaation tasoilla.

ribonukleaasi A -entsyymin3D-konformaatio

Nämä entsyymit esiintyvät kaikissa elävissä soluissa ja biologisissa nesteissä, mukaan lukien prokaryooteissa ja eukaryooteissa, ja ne suorittavat monia tärkeitä tehtäviä. RNaasit ovat ubiikkisia, ja niiden elinikä suojaamattomassa ympäristössä on hyvin lyhyt. Sytotoksisiin vaikutuksiin kuuluu RNA:n pilkkominen, joka johtaa proteiinisynteesin estymiseen ja apoptoosin induktioon. Nämä sytotoksiset vaikutukset voidaan tuottaa levittämällä RNaasia solun ulkopinnalle, mutta on havaittu, että sytotoksisuus lisääntyy 1000-kertaiseksi, kun entsyymi tuodaan keinotekoisesti sytosoliin, mikä viittaa siihen, että internalisaatio solun sisälle on myrkyllisyyden nopeutta rajoittava vaihe.

RNaasit luokitellaan endoribonukleaaseihin ja eksoribonukleaaseihin. Endoribonukleaaseja ovat muodot A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM ja V.

Eksoribonukleaaseihin kuuluvat RNaasimuodot PH, II, R, D ja T sekä polynukleotidifosforylaasi (PNPaasi), oligoribonukleaasi, eksoribonukleaasi I ja eksoribonukleaasi II. Nämä entsyymit pilkkovat eri RNA-lajeja eri tavoin.

Viime aikoina tutkijat ovat kiinnittäneet huomiota RNaaseihin mahdollisina syövän hoitoaineina. Ajatuksena on löytää entsyymi, joka vahingoittaa valikoivasti syöpäsoluja vaikuttamatta ympäröiviin normaaleihin soluihin.

RNAASI A -tuotteet AG Scientific, Inc.

Usein kysyttyjä kysymyksiä RNaasi A:sta

Mikä on RNaasi A?

Ribonukleaasi A on haiman erittämä ruoansulatusentsyymi, joka spesifisesti ”sulattaa” tai hydrolysoi RNA-polymeerejä (mutta ei DNA:ta) pilkkomalla endonukleaasilla fosfodiesterisidoksia, jotka muodostavat kovalenttiset sidokset näiden molekyylien vierekkäisten ribonukleotidijäämien välillä.

Mitä ”A” tarkoittaa RNase A:ssa?

Nimen ”A” ei viittaa sen substraattispesifisyyteen, vaan naudan haiman tuottaman entsyymin vallitsevaan muotoon. RNaasi A on modifioimaton, kun taas RNaasi B, RNaasi C ja RNaasi D ovat glykoformien sekoituksia.

Koska RNaasi A:ta on saatavissa suuria määriä ja se on erittäin puhdasta, se on ollut proteiinikemian ja entsymologian merkkiteosten kohteena. Lisäksi entsyymin sytotoksiset variantit ja homologit ovat osoittaneet käyttökelpoisuutensa kemoterapeuttisina aineina.

Mikä on tämän entsyymin historia?

Christian Anfinsen käytti sitä todistaakseen, että aminohappojen järjestys, määrää taitetun proteiinin rakenteen, ja Stanford Moore ja William Stein käyttivät sitä osoittaakseen, että entsyymien katalyyttisessä keskuksessa käytetään tiettyä aminohappojen järjestystä.

Ribonukleaasi A oli myös ensimmäinen R. Bruce Merrifieldin syntetisoima entsyymi, joka osoitti, että biologiset molekyylit ovat yksinkertaisesti kemiallisia kokonaisuuksia, jotka voidaan rakentaa keinotekoisesti. Kaikki nämä keskeiset käsitteet, jotka löydettiin ribonukleaasin avulla, palkittiin Nobel-palkinnoilla.

Mikä on RNaasi A:n rakenne?

RNAASIN RAKENNE

RNAASI A:n suhteellisen pieni, 124 aminohappoa sisältävä sekvenssi, jonka molekyylimassa on 12 600 Da, sisältää neljä His-jäämää, joista kaksi His12- ja His119-jäämää vaikuttavat suoraan tämän entsyymin katalyyttisiksi jäämiksi. His12:n imidatsolirenkaalla on nimettömän alhainen pK-arvo (pK < 6,0), mikä viittaa siihen, että sen on oltava deprotonoitu katalyysia varten. Sitä vastoin His119:n imidatsolirenkaalla on nimettömän korkea pK-arvo (pK > 6,0), mikä viittaa siihen, että sen on oltava protonoitu katalyysia varten.

Onko Ribonukleaasi A proteiini?

RNaasi A on pieni proteiini, kypsässä entsyymissä on vain 124 aminohappojäännöstä eikä siihen ole kiinnittynyt hiilihydraattia. Muista entsyymeistä poiketen RNaasi A sisältää 19 happoa 20:stä, vain tryptofaani puuttuu.

Mikä on vaikutusmekanismi?

His12 toimii yleisenä emäksenä, joka hyväksyy 2′-OH-protonin sessiilisestä ribonukleiinisokerirenkaasta. Tämä edistää 2′-O:n nukleofiilistä hyökkäystä positiivisemmin varautuneeseen fosforiatomiin (P), jolloin syntyy 2′-,3′-syklinen ribonukleotidifosfaattiväliaine. Tämän välituotteen syntymistä helpottaa His119:n imidatsoli, joka toimii yleisenä happona luovuttaen protoninsa happiatomille herkässä P-O-R’-sidoksessa.

Reaktion toisessa vaiheessa näiden kahden His-jäännöksen sivuketjujen yleiset happo- ja emästoiminnot ovat päinvastaiset. His12 toimii yleisenä happona luovuttaen vasta hankkimansa protonin 2′-,3′-sykliseen ribonukleotidifosfaattivälituotteeseen, kun taas His119, joka toimii yleisenä emäksenä, ottaa vedestä protonin edistääkseen hydroksyylihyökkäystä samaan 2′-,3′-sykliseen välituotteeseen.

Mikä on RNaasi A:n pilkkomiskohta?

RNAasi A hydrolysoi tehokkaasti DNA-valmisteissa olevia RNA-kontaminaatioita pilkkomalla pyrimidiininukleotidin (C ja U) 3′-fosfaattiryhmän ja sen viereisen nukleotidin 1, 2, 3 5′-riboosin välisen fosfodiesterisidoksen. Syntynyt 2′-,3′-syklinen fosfodiesteri hydrolysoidaan edelleen 3′-monofosfaattiryhmäksi. Naudan haiman RNaasi A on erittäin stabiili 124 aminohapon proteiini, jolla on suurin mitattu aktiivisuus yksijuosteista RNA:ta kohtaan ja kaksi kertaa nopeampi pilkkoutumisnopeus sytidiinijäämien kohdalla verrattuna uridyylijäämiin.

Millainen on RNaasi A:n happo/emäs-katalyysireaktio?

RNaasi A käyttää happo/emäs-katalyyttiä myös muuttaakseen substraattejaan kemiallisesti. Entsyymin happamat tai emäksiset jäännökset siirtävät protoneja reagoivaan aineeseen tai reagoivasta aineesta stabiloidakseen kehittyvät varaukset siirtymätilassa. Protonien siirto luo yleensä parempia poistuvia ryhmiä, mikä tekee reaktiosta energeettisesti edullisemman.

Histidiini on hyvin yleinen katalyysiin osallistuva aminohappojäännös, sillä histidiinin pKa-arvo on lähellä neutraalia (pKa=6); siksi histidiini voi sekä ottaa vastaan että luovuttaa protoneja fysiologisessa pH:ssa.

Millainen on ribonukleaasi A:n stabiilisuus?

Ribonukleaasi A:n stabiilisuus on hämmästyttävän hyvä. Esimerkiksi eräässä menettelyssä, jolla puhdistetaan ribonukleaasi A lehmän haimasta, uutteet käsitellään rikkihapolla ja kuumennetaan sitten lähes kiehuviksi, ja ribonukleaasi A on ainoa, joka selviää. Tämä ei ole yllättävää, koska se on haiman erittämä ja sen on suoritettava tehtävänsä ruoansulatuskanavan epäsuotuisassa ympäristössä. Ribonukleaasi A:n stabiilisuus johtuu suurelta osin neljästä disulfidisidoksesta, jotka liimaavat ketjun eri osia toisiinsa.

Yleisesti ottaen stabiilisuuden säilyttämiseksi tuotetta on säilytettävä ja käsiteltävä myyjän ohjeiden mukaisesti.

Miten RNaasi A:ta inaktivoidaan?

RNaasi A on melko stabiili entsyymi, ja siinä on neljä disulfidisiltaa, joita esiintyy kaikissa nisäkkäiden haiman ribonukleaaseissa. Kun sillat katkeavat reduktiivisesti, proteiini denaturoituu ja muuttuu inaktiiviseksi. Uudelleen hapettuessaan proteiini taittuu uudelleen ja täydellinen aktiivisuus palautuu. On kuitenkin mahdollista pelkistää sillat vain osittain ja säilyttää entsyymiaktiivisuus. Neljän peptidin poistaminen karboksyyliterminaalista tuhoaa entsyymiaktiivisuuden.

Mikä estää RNaasi A:ta?

Uridiinivanadaatti on voimakas kilpaileva RNaasi A:n estäjä. Sen tekee niin voimakkaaksi se, että sen rakenne jäljittelee siirtymätilaa, joka on reaktiossa välituotteena.

Miten RNaasi A valmistetaan varastosta?

RNAASI A valmistetaan tyypillisesti keittämällä varastoa 10 minuutin ajan kontaminoivan DNaasiaktiivisuuden poistamiseksi vaikuttamatta RNaasiin. Kuumentaminen 65 °C:seen ei vaikuta RNaasiin.

Miten valmistettu RNaasi A:n kanta rekonstruoidaan?

RNAASI A voidaan liuottaa pitoisuuteen 1-10 mg/ml 10 mM Tris-HCl:ään, pH 7.5, 15 mM NaCl, kuumennetaan 100 °C:seen 15 minuutin ajaksi kontaminoivien DNaasien inaktivoimiseksi ja jäähdytetään hitaasti huoneenlämpötilaan ja annostellaan alikvootteihin.

Mikä on tämän entsyymin käyttökonsentraatio?

RNAasi A:n suositeltu käyttökonsentraatio on 1-100 µg/ml sovelluksesta riippuen. Entsyymi on aktiivinen monenlaisissa reaktio-olosuhteissa. Pienissä suolapitoisuuksissa (0-100 mM NaCl) RNaasi A pilkkoo yksi- ja kaksijuosteista RNA:ta sekä RNA-DNA-hybridien RNA-juostetta.

Mikä on tämän tuotteen säilytyslämpötila ja käsittelytoimenpiteet?

Säilytä tiiviisti suljetussa injektiopullossa -20 ºC:ssa. Kun se on avattu, dehydratoi se silikageelin päällä tyhjiössä ennen palauttamista -20ºC:een. Ole varovainen käsitellessäsi. Älä käytä tätä yhdistettä, jos et ole täysin koulutettu tai et ole tietoinen siihen liittyvistä vaaroista.

Mitkä ovat RNase A:n käyttökohteet?

RNaaseilla on tärkeä rooli RNA:n hajoamisessa ja liikevaihdossa kaikissa organismeissa. Ribonukleaasientsyymi voi purkaa RNA-kierteen muodostamalla kompleksin yksijuosteisen RNA:n kanssa.

RNaasi A on endoribonukleaasi, jolla on tehtäviä RNA:n aineenvaihdunnassa ja geeniekspression säätelyssä.

RNaasi A:lla on todettu olevan tärkeä rooli sairauksissa, kuten autoimmuunisairauksissa, munuaisten vajaatoiminnassa ja haimasairauksissa. Viime aikoina on raportoitu myös kasvainten vastaista toimintaa RNaasi A:lle, jolla on sytotoksisia ja sytostaattisia ominaisuuksia. RNaasi A -superperheen jäsenet ekspressoituvat laajalti, ja niitä esiintyy nisäkkäiden seerumissa ja kudoksissa.

Ensiymiä voidaan käyttää RNA:n hydrolysoimiseen proteiininäytteistä. Se soveltuu käytettäväksi RNaasisuojausmäärityksissä, epäspesifisesti sitoutuneen RNA:n poistamiseen, RNA-sekvenssien analysointiin, proteiininäytteiden sisältämän RNA:n hydrolysoimiseen ja DNA:n puhdistukseen.

Millainen on tämän tuotteen ulkonäkö/muoto?

Toimitetaan valkoisena kromatografisesti puhdistettuna, suolattomana, kylmäkuivattuna jauheena. Tuotteen ulkonäkö/muoto saattaa vaihdella valmistajasta riippuen.

Lisälukemista

• DNA-kontaminaation lähteet laboratoriossa
• Guanidiinitiosyanaatti RNA:n lyysipuskureissa
• 8 AGS:n valinnan etuja. Proteinase K:n toimittajaksi

.