Strep-tag

Aivan kuten muutkin lyhyen affiniteetin tagit (His-tag, FLAG-tag), Strep-tag voidaan helposti fuusioida rekombinanttiproteiineihin sen cDNA:n tai geenin subkloonauksen aikana. Sen ilmentämiseen on saatavilla erilaisia vektoreita eri isäntäorganismeille (E. coli, hiiva, hyönteiset ja nisäkässolut). Strep-tagin erityinen etu on sen melko pieni koko ja se, että se on biokemiallisesti lähes inertti. Näin ollen se ei vaikuta proteiinin taittumiseen tai erittymiseen eikä yleensä häiritse proteiinin toimintaa. Strep-tag soveltuu erityisesti funktionaalisten proteiinien analysointiin, koska puhdistusprosessi voidaan pitää fysiologisissa olosuhteissa. Tämä ei ainoastaan mahdollista herkkien proteiinien eristämistä natiivissa tilassa, vaan on myös mahdollista puhdistaa ehjiä proteiinikomplekseja, vaikka vain yksi alayksikkö kantaisi tagia.

Strep-tag-puhdistussyklin ensimmäisessä vaiheessa Strep-tag-fuusioproteiinia sisältävä solulysaatti levitetään kolonniin, jossa on immobilisoitua Strep-taktiiniä (vaihe 1). Kun merkitty proteiini on sitoutunut spesifisesti Strep-taktiiniin, lyhyt pesuvaihe fysiologisella puskurilla (esim. PBS) poistaa kaikki muut isäntäproteiinit (vaihe 2). Tämä johtuu sen poikkeuksellisen alhaisesta taipumuksesta sitoutua proteiineihin epäspesifisesti. Tämän jälkeen puhdistettu Strep-tag-fuusioproteiini eluoidaan varovasti pienellä pitoisuudella destiobiotiinia, joka kilpailee spesifisesti biotiinin sitoutumistaskusta (vaihe 3). Kolonnin regeneroimiseksi destiobiotiini poistetaan HABA:ta sisältävällä liuoksella (keltainen atsoväri). Destiobiotiinin poistuminen näkyy värin muuttumisena kelta-oranssista punaiseksi (vaihe 4+5).Lopuksi HABA-liuos pestään pois pienellä määrällä juoksutuspuskuria, jolloin kolonni on valmis käytettäväksi seuraavaan puhdistusajoon.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.