Instrument et réactifs
L’instrument pour la détection du MTX était Siemens VIVA-E qui permet la personnalisation des paramètres grâce à la disponibilité d’un canal ouvert. Les réactifs et les calibrateurs MTX ont été achetés auprès de Siemens (6L119UL).
Trois niveaux de matériel de contrôle de qualité (CQ) ont été achetés auprès de Bio-Rad (Irvine, CA), un matériel de CQ personnalisé supplémentaire à 0,05 μmol/L auprès d’Aladdin (Shanghai, Chine).
La comparaison de la méthode MTX a été effectuée en analysant les mêmes échantillons à l’aide d’un dosage par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) (chromatographie liquide LC-20 AD, et spectromètres de masse AB SCIEX QTRAP®4500).
Spécimens
Les échantillons testés ont été obtenus auprès du service hématologique de l’hôpital pour enfants de Dalian. Certains échantillons testés et des échantillons de plasma ictérique sans MTX ont été collectés pour étudier l’interférence des triglycérides et de la bilirubine. Il n’y a pas eu d’intervention dans le traitement des patients, et aucune information individuelle du patient n’a été mentionnée.
Préparation des réactifs
Le kit de réactifs Siemens contient le réactif anticorps/substrat A, le réactif enzymatique B, le concentré de tampon d’essai de médicament Emit et les calibrateurs de méthotrexate Emit. Les réactifs A et B ont été reconstitués avec 3,0 ml d’eau désionisée, mélangés par agitation légère et équilibrés à température ambiante pendant 1 h. Le concentré de tampon MTX a été mélangé avec de l’eau désionisée (1:15 v/v). La solution de travail du réactif A et B a été préparée en diluant les solutions mères 1:9 v/v avec la solution tampon.
Certains calibrateurs (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/L) ont été reconstitués à la concentration indiquée avec 1.0 mL d’eau désionisée selon les instructions du fabricant, d’autres calibrateurs 1,50 et 2,00 μmol/L ont été reconstitués à la concentration indiquée avec 1,50 et 2,00 mL d’eau désionisée respectivement. Ensuite, le calibrateur 0,20 μmol/L a été dilué en 0,05 μmol/L, et le 1,00 μmol/L a été dilué en 0,10 et 0,25 μmol/L. Le nouvel ensemble de calibrateurs (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 et 1,00 μmol/L) répond aux exigences de la courbe d’étalonnage modifiée.
Programmation de l’instrument Viva-E
Un canal ouvert sur le Viva-E a été programmé pour changer les volumes des réactifs A & B de 180 μL à 110 μL (110 μL est la limite inférieure du Viva-E pour les réactifs MTX). Une courbe d’étalonnage en six points a été programmée avec une régression par spline cubique modifiée. Les six calibrateurs fournis par le kit étaient 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 et 2,00 μmol/L. Lorsque les volumes des réactifs A et B ont été diminués, ils n’étaient pas suffisants pour réagir avec des échantillons supérieurs à 1 μmol/L. Par conséquent, le nouveau jeu de calibrateurs du dosage EMIT modifié a été modifié pour 0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L dans une plage de 0,05 à 1,00 μmol/L.
Selon l’instruction du kit commercial, les échantillons de concentration supérieure à 1,00 μmol/L doivent être dilués dans l’étendue de la courbe d’étalonnage (0.05-1,00 μmol/L) en utilisant un facteur de dilution de 10, 100 ou 1000.
La limite du blanc, la limite de détection, la limite de quantification
La limite du blanc (LOB), la limite de détection (LOD), la limite de quantification (LOQ) ont été déterminées selon CLSI EP17-A . La LOB a été dosée en utilisant six échantillons (S1-S6, 10 répétitions sur 10 jours) : S1 et S2 étaient des calibrateurs zéro provenant de deux lots de calibrateurs différents, S3 et S4 étaient des diluants, S5 et S6 étaient des plasmas vierges. La LOD a été testée avec 5 pools d’échantillons de faible niveau allant de la LOB à quatre fois la LOB (12 répétitions sur 12 jours). La LOB et la LOD ont été déterminées par deux lots de réactifs. Selon les exigences cliniques, l’objectif de l’erreur totale a été fixé à 20 %. Les résultats de l’étude LOD ont été utilisés pour estimer le biais et l’imprécision pour chaque niveau de l’analyte. Ensuite, ces données ont été combinées pour estimer l’erreur totale à chaque niveau et déterminer la limite de quantification (LOQ).
Imprecision intra-jour et inter-jour
L’imprécision intra-jour (n = 10) du dosage modifié a été évaluée par un niveau de matériaux de contrôle (0,05 μmol/L) et trois niveaux d’échantillons de patients (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L). À chaque niveau, 10 répétitions ont été effectuées. L’imprécision inter-journalière (n = 25) a été testée à ces 4 niveaux sur 5 jours consécutifs, et 5 réplicats pour chaque niveau. Tous les échantillons ont été obtenus à partir de patients différents. Les résultats mesurés ont été tracés par rapport aux valeurs attendues.
Linéarité
La linéarité a été vérifiée en diluant le contrôle de qualité de 2,00 μmol/L (hc) avec du tampon (c0) aux rapports suivants : 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Chaque dilution a été analysée trois fois, l’équation de linéarité du dosage modifié a été calculée sur la base des moyennes des résultats mesurés et des valeurs attendues.
La procédure de dosage LC-MS/MS
Le dosage LC-MS/MS réalisé dans cette étude est le suivant. La diphénhydramine a été utilisée comme standard interne. L’acétonitrile a été utilisé comme précipitant du sérum pour éliminer l’albumine. Une colonne Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) a été utilisée pour les séparations LC. La phase mobile était composée d’acide formique à 0,1 % et d’acétonitrile. L’élution par gradient a été réalisée à un débit de 0,5 mL/min à 30 °C. Le mode de surveillance des réactions multiples (MRM) a été utilisé pour détecter le MTX et la diphénhydramine dans la source d’ionisation électrospray (ESI) et le mode de balayage des ions positifs. Le MTX a été détecté à m/z 455,0 → 308,1, la diphénhydramine a été détectée à m/z 256,0 → 167,0 .
Comparaison des méthodes
Soixante-dix-neuf échantillons ont été recueillis auprès de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë dans le service hématologique de l’hôpital pour enfants de Dalian. Chaque échantillon a été testé en utilisant respectivement le test EMIT modifié et le test LC-MS/MS. Les résultats ont été comparés à l’aide d’une analyse de régression linéaire simple (logiciel statistique MedCalc version 15.6.1). 45 autres échantillons ont été testés à l’aide du test EMIT modifié et du test EMIT commercial pour la comparaison des méthodes .
Etudes d’interférence
L’interférence des triglycérides a été évaluée en préparant des échantillons avec de l’Intralipide (émulsion de graisse IV à 20 %). La concentration de triglycérides dans les échantillons était de 1000 ng/dL. Ensuite, le test Paired-T a été effectué.
L’interférence de la bilirubine a été simulée en utilisant certains échantillons de plasma ictérique sans MTX avec une concentration de bilirubine non inférieure à 30 mg/dL.
L’interférence du métabolite structurellement apparenté 7-hydroxy-méthotrexate a été évaluée en ajoutant différents niveaux de 7-hydroxy-méthotrexate aux échantillons de plasma, la concentration de MTX dans ces échantillons était de 0,05 μmoL/L. Et les résultats des tests des échantillons actuels ont été comparés aux résultats des échantillons originaux .