Bevezetés
A mikrobáknak körülbelül 10 000 elnevezett faja van. Becslések szerint minden egyes azonosított fajra további 10 000 és 100 000 közötti azonosítatlan faj jut. Nemcsak sokféle baktérium létezik, hanem rengeteg egyedi baktérium is. Egyetlen kanálnyi talajban akár 100 millió egyedi baktérium is lehet. Az ínyünk lekaparása 1 millió baktériumot eredményezhet cm2 -enként (egy cm2 körülbelül akkora, mint a kis körmünk). A testünkben és a testünkön található baktériumok a száraz testtömegünk mintegy 10%-át teszik ki.
A jelenleg ismert baktériumfajok többségét hagyományos mikrobiológiai módszerekkel azonosították, mint például a gram-festési reakció, a morfológia és az anyagcsere-reakciók. A baktériumok ritkán élnek egyedül, hanem más baktériumokkal alkotott közösségekben. Ez igaz mind a környezetben, mind a testünkben és a testünkön. Ez az óra a baktériumok betegségekben betöltött szerepére összpontosít. Egyetlen baktériumfaj izolálása az első lépés a betegségért esetleg felelős baktériumok azonosításában.
A baktérium fizikai izolálásának első feltétele, hogy a laboratóriumban tenyészthető legyen. Ehhez ismerni kell a növekedéshez szükséges optimális hőmérsékletet, az optimális oxigénigényt és az optimális tápanyagigényt. Ezen a kurzuson nagyon korlátozott számú baktériummal dolgozunk. A baktériumok, amelyekkel dolgozunk, szintén nagyon könnyen tenyészthetők a laboratóriumban. A legtöbb baktérium nem ilyen kellemes!
A szervezetek izolálásának két fő módja van.
- Az agarlemezen történő izolálásra való törés
- A pour plate módszer
Az agarlemezen történő izolálásra való törés során a szervezeteket egymás után hígítjuk, amíg a sejtek sűrűsége elég alacsony nem lesz ahhoz, hogy az egyes sejtek fizikailag térben elkülönülve felismerhető egyedi telepeket hozzanak létre. Az öntőlapos módszer során a mintát kellőképpen felhígítjuk, mielőtt olvasztott, lehűtött agarhoz adjuk, majd ezt a keveréket egy tálba öntjük. Az izolált sejtekből egyedi kolóniák keletkeznek, amelyek magában az agarban nőnek. Ez a technika kissé trükkös lehet. Ha az olvasztott agar túl forró, az összes baktériumot elpusztítja. Ha az olvasztott agar túl hideg, akkor egy nagy csomó marad a Petri-csészében. A csíkozásos módszerrel az agar felszínén egyedi telepeket hozhatunk létre. Ez a technika sokkal gyorsabb és könnyebben elsajátítható.
Áttekintés
Három organizmust, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens és Escherichia. coli-t tartalmazó húslevesmintát fog kapni.
Mindhárom organizmus könnyen növekszik aerob módon a triptikus szója agaron (TSA). A S. marsescens azonban csak 35 °C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten és optimális esetben szobahőmérsékleten (25 °C) képez vörös pigmentet. Minden hőmérsékleten nagyon gyorsan növekszik, és közepes méretű kolóniákat képez.
Az E. coli minden hőmérsékleten barnásbarna színű, és szintén gyorsan növekszik, és nagy kolóniákat képez.
A S. xylosus minden hőmérsékleten sárgás-narancsos színű, gyorsan növekszik, és közepes vagy nagy kolóniákat képez.
A megfelelő inkubációs körülményektől függ, hogy a három organizmust el tudja-e különíteni és látni tudja-e a lemezen. A lemezeket 48 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Képesnek kell lennie a három organizmust azonosítani a kolóniaméret és a pigment alapján.
Az anyagok
- 1 kevert tenyészet triptikus szójaleves (TSB) csőben, amely Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens és Escherichia. Coli (mind BSL2)
- 3 TSA lemez
Az izolálási eljáráshoz való csíkozás
Az izoláláshoz való csíkozásnak többféle módszere van. Diákjaink túlnyomó többsége a legsikeresebben a csíkozás kvadráns módszerével járt, amelyet az alábbiakban ismertetünk.
- A tányérját címkézze fel nevével, dátumával, szekciójával és organizmusával.
- A BSL2 eljárásokkal szerezzen egy huroknyi organizmust a triptikus szójaleves (TSB) csőből. Lásd az aszeptikus technika protokollját.
- Győződjön meg róla, hogy megfelelően összekeverte a TSB-csövét, hogy az organizmusok egyenletesen szuszpendálódjanak a húslevesben.
- Fedje újra a TSB-csövét.
- A következő részt a laboratóriumi padon lévő vagy a kezében tartott lemezével végezheti. Ön dönti el, melyik működik jobban. Könnyedén húzza a hurkát előre-hátra az agar felszínén. (Lásd az 1. ábrát.)
- Minél jobban húzza, annál több baktérium rakódik le.
- Az általános ötlet az, hogy minden egyes húzással csökkentse a baktériumkoncentrációt.
- Négy-öt cikk-cakk tűnik jól működőnek.
- Kísérletezzen a különböző lemezekkel. Ügyeljen arra, hogy nyomon kövesse, mit csinált az egyes lemezeken.
- Ha hamvasztót használ, sterilizálja a hurkot. Ha műanyag hurkot használ, dobja ki a használt hurkot a kavicid tartályba, és szerezzen be egy új steril műanyag hurkot.
- Ne menjen vissza az eredeti húsleves csőbe.
- A hurokkal érintse meg az agarfelületet az első csík távoli végével szemben. Ismételje meg az eljárást előre-hátra húzással.
- o Ne húzza a lemez közepére.
- o Látnia kell a csíkozás vonalának halvány bemélyedéseit az agarfelületen.
- A steril hurok segítségével ismételje meg az eljárást a második csíkkal.
- A steril hurok segítségével ismételje meg az eljárást a harmadik csíkkal. Az utolsó részt cikcakkban vigye a lemez közepére.
- Az utolsó csíkban valahol izolált kolóniákat kell találnia.
- Ha hamvasztót használ, sterilizálja a hurkot. Ha műanyag hurkot használ, dobja el a használt hurkot az üregirtó tartályba.
- Tegye vissza a fedelet a lemezére.
- A kész lemezeket agarral felfelé helyezze az inkubációs állványra az elülső asztalon az inkubációs részlegben.
1. ábra: Az izoláláshoz szükséges csíkozás kvadránsos módszere.
Jegyzetek
- Elkerülhetetlen, hogy minden egyes csíkozás között sterilizálja a hurkot, akár az égetőgép használatával, akár egy új steril műanyag hurok beszerzésével. Ez a leggyakoribb hiba, amit a diákok elkövetnek.
- Ne hagyja túl sokáig nyitva a lemezét, különben a környezetből extra baktériumok kerülnek a lemezére.
- Ne legyen csalódott, ha nem kap izolált kolóniákat elsőre. Ez egy nehéz eljárás.