Táblázat 1
gerjesztés, emisszió és fényerő
Ha több fluoreszcens címkét tervez használni, fontos, hogy olyanokat válasszon, amelyeknek határozott emissziós csúcsai vannak – valamint olyan gerjesztési csúcsok, amelyeket a rendelkezésre álló lézerekkel meg tud célozni. Ha az emissziós csúcsok átfedik egymást, akkor nehéz, vagy esetleg lehetetlen lesz megkülönböztetni őket.
Jellemzően a rendelkezésre álló spektrumon belül a legfényesebb fluoreszcens címkét szeretné, hogy egyértelmű jelet kapjon, és leküzdje az esetleges háttér-fluoreszcenciát. A fényerő értékek a fehérje extinkciós együtthatójának és a kvantumhozamnak a szorzatából adódnak. Az így kapott szám azonban nehezen értelmezhető, ezért a fluoreszcens címkének egy jól meghatározott címkéhez, például az EGFP-hez viszonyított fényessége gyakori alternatív mérőszám.
Szaturáció és fehérítés
A szaturáció azt határozza meg, hogy a fluoreszcens címkének mennyi időbe telik, amíg megfelelően összecsukódik, kialakul a kromofór és elkezd fluoreszkálni. Az élő sejtekben zajló időérzékeny események esetében fontos lehet a rövid érési idő. A szuperfolder GFP (sfGFP) például kevesebb mint 10 perc alatt összehajtható, míg az mOrange több mint négy órát vesz igénybe.
A kifehéredés a fotostabilitás mérőszáma, vagyis hogy a kromofór a gerjesztés után mennyi idővel veszíti el fénykibocsátó képességét. Ha hosszú time-lapse kísérleteket tervez, fontolja meg a nagy fotostabilitású címkéket. A T-szafír fehérülési felezési ideje (t½; az az idő, amíg a kezdeti x foton/s-os emissziós sebesség a felére csökken) 25 másodperc, de az EGFP sokkal stabilabb, fehérülési t½-je 174 másodperc.
Környezeti körülmények
A legtöbb fehérjéhez hasonlóan a fluoreszcens címkéket is befolyásolja a pH, a hőmérséklet és az oxigénszint. Attól függően, hogy milyen környezetet kíván használni, szükség lehet a feltételek kismértékű módosítására vagy egy megfelelőbb tag kiválasztására.
A pH befolyásolhatja a gerjesztési és emissziós csúcsokat, és a fluoreszcens tagek többsége érzékeny a savakra: egyesek még a fluoreszcencia intenzitását is képesek megváltoztatni a pH változásakor (pl. pHTomato). A pKa érték jó mutatója a pH-érzékenységnek, mivel azt a pH-t mutatja, amelynél a kromofórák fele fluoreszkál.
A hőmérséklet és az oxigénszint is befolyásolja az érési időt: a hipoxiás körülmények általában késleltetik az érési időt, csakúgy, mint a fluoreszcens címkék optimális tartományán kívüli hőmérséklet (pl. az EGFP-t 37°C-ra optimalizálták). Az újabb fluoreszcens címkék, mint például az UnaG, a japán édesvízi angolnából (Anguilla japonica) izolált GFP azonban alacsony oxigénszint mellett is fluoreszkál3.
Kodonoptimalizálás
Mivel a legtöbb fluoreszcens tag medúzák vagy korallok fehérjéiből származik, nem pedig olyanokból, mint amilyenekben az emlősök sejtjeiben és szöveteiben valószínűleg használni fogjuk, a használt aminosav-kodonok között fajközi különbség lehet. Ez gyenge expresszióhoz és ezért alacsony jelhez vezethet.
Szerencsére a fluoreszcens címkék számos újabb változatát kodonoptimalizálták az emlőssejtek preferenciáinak megfelelően. A GFP esetében például Jürgen Haas és munkatársai 40-120-szorosára javították a jelet a GFP kodonszekvenciájának módosításával4.
Ha egy régebbi plazmidot használ a fúziós fehérjék előállításához, akkor az nem tartalmazhat módosított fluoreszcens tag szekvenciát. Ezért mindig ellenőrizze, hogy a szekvenciát módosították-e az adott fajban való használathoz.
Oligomerizáció
Nem mindegy, hogy a tag monomer vagy dimer (a monomereket általában egy “m” előtaggal jelölik a fehérje neve előtt, pl. mCherry), és hogy ez befolyásolja-e a kísérletet. A korai fluoreszcens címkék közül sok hajlamos volt oligomereket képezni, és az oligomerizáció befolyásolhatja a fúziós fehérje biológiai funkcióját. Az EGFP például egy monomer, amely elég nagy koncentrációban használva dimereket képezhet, ami torzíthatja a szubcelluláris organellákat5 vagy megzavarhatja az olyan kísérleteket, mint a FRET6. Az esetek túlnyomó többségében a valóban monomer FP-k használata ajánlott.
GFP és mCherry termékek