Készülék és reagensek
Az MTX kimutatására szolgáló készülék a Siemens VIVA-E volt, amely a nyitott csatorna rendelkezésre állása révén lehetővé teszi a paraméterek testre szabását. Az MTX-reagenseket és kalibrátorokat a Siemens-től vásároltuk (6L119UL).
Három szintű minőségellenőrzési (QC) anyagot a Bio-Rad-tól (Irvine, CA), egy további egyedi QC anyagot 0,05 μmol/L-es szinten az Aladdin-tól (Shanghai, Kína) vásároltunk.
MTX módszer összehasonlítását ugyanazon minták folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) analízissel történő elemzésével végeztük (LC-20 AD folyadékkromatográfia és AB SCIEX QTRAP®4500 tömegspektrométerek).
Minták
A vizsgálati minták a Dalian gyermekkórház hematológiai osztályáról származnak. Néhány vizsgált mintát és MTX-mentes ikterikus plazmamintát gyűjtöttünk a triglicerid- és bilirubininterferencia vizsgálatához. A betegek kezelésébe nem történt beavatkozás, és a betegek egyéni adatait nem említettük.
Reagensek előkészítése
A Siemens Reagens Kit tartalmazza az Antitest/Szubsztrát Reagens A-t, az Enzim Reagens B-t, az Emit Drug Assay Buffer Concentrate-ot és az Emit Methotrexate Calibrators-t. Az A és B reagenst 3,0 ml deionizált vízzel állítottuk helyre, óvatos keveréssel összekevertük, és szobahőmérsékleten 1 órán át egyensúlyba hoztuk. Az MTX pufferkoncentrátumot deionizált vízzel kevertük (1:15 v/v). Az A és B reagensek munkaoldatát a törzsoldatok 1:9 v/v pufferoldattal történő hígításával készítettük.
Egyes kalibrátorokat (0, 0,20, 0,50, 1,00 μmol/l) a megadott koncentrációra 1. sz.0 mL deionizált vízzel a gyártó utasításainak megfelelően, más 1,50 és 2,00 μmol/L kalibrátorokat 1,50 és 2,00 mL deionizált vízzel állítottunk vissza 1,00 μmol/L-re. Ezután a 0,20 μmol/L kalibrátort 0,05 μmol/L-re, az 1,00 μmol/L-t pedig 0,10 és 0,25 μmol/L-re hígítottuk. A kalibrátorok új készlete (0, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 és 1,00 μmol/L) megfelel a módosított kalibrátorgörbe követelményeinek.
A Viva-E készülék programozása
A Viva-E készülék nyitott csatornáját úgy programoztuk, hogy az A & B reagensek térfogata 180 μL-ről 110 μL-re változzon (110 μL a Viva-E készülék alsó határa az MTX reagensek számára). Hatpontos kalibrációs görbét programoztunk módosított köbös spline regresszióval. A készlet által biztosított hat kalibrátor 0, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50 és 2,00 μmol/l volt. Amikor az A és B reagensek térfogatát csökkentettük, azok nem voltak elegendőek az 1 μmol/L-nél nagyobb minták reakciójához. Ennek eredményeképpen a módosított EMIT-teszt új kalibrátorkészletét 0, 0,05, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 μmol/L tartományon belül 0,05-1,00 μmol/L-re módosították.
A kereskedelmi készlet utasítása szerint az 1,00 μmol/L-nél nagyobb koncentrációjú mintákat a kalibrációs görbe tartományába kell hígítani (0.05-1,00 μmol/L) 10, 100 vagy 1000 hígítási tényezővel.
Vakranyaghatár, kimutatási határ, mennyiségi határ
Vakranyaghatár (LOB), kimutatási határ (LOD), mennyiségi határ (LOQ) meghatározása a CLSI EP17-A szerint történt. A LOB-t hat minta (S1-S6, 10 ismétlés 10 nap alatt) felhasználásával határozták meg: Az S1 és S2 két különböző kalibrátortételből származó nullkalibrátor, az S3 és S4 hígító, az S5 és S6 vak plazma volt. A LOD-t 5 alacsony koncentrációjú mintacsoporttal vizsgálták, amelyek a LOB-től a LOB négyszereséig terjedtek (12 ismétlés 12 napon keresztül). A LOB-t és a LOD-ot két tétel reagenssel határozták meg. A klinikai követelményeknek megfelelően a teljes hiba célértékét 20%-ban határoztuk meg. A LOD-vizsgálat vizsgálati eredményeit használták az eltérés és a pontatlanság becslésére az analit minden egyes szintjére vonatkozóan. Ezután ezeket az adatokat kombinálták az egyes szintek teljes hibájának becsléséhez és a mennyiségi határérték (LOQ) meghatározásához.
Napközbeni és napközi pontatlanság
A módosított vizsgálat napközbeni (n = 10) pontatlanságát a kontrollanyagok egy szintje (0,05 μmol/L) és a betegminták három szintje (0,12, 0,43, 0,82 μmol/L) alapján értékelték. Minden szinten 10 ismétlést végeztünk. A napok közötti (n = 25) pontatlanságot ezen a 4 szinten 5 egymást követő napon, és minden szinten 5 ismétléssel vizsgáltuk. Az összes mintát különböző betegektől nyertük. A mért eredményeket a várható értékekkel szemben ábrázoltuk.
Linearitás
A linearitást úgy ellenőriztük, hogy a 2,00 μmol/L (hc) minőségi kontrollt pufferrel (c0) hígítottuk a következő arányokban: 1hc + 1c0 (1,00 μmol/L), 2hc + 3c0 (0,80 μmol/L), 1hc + 2co (0,67 μmol/L), 1hc + 3co (0.50 μmol/L), 1hc + 5co (0,33 μmol/L), 1hc + 9co (0,20 μmol/L), 1hc + 19co (0,10 μmol/L), 1hc + 39co (0,05 μmol/L). Minden hígítást háromszor elemeztünk, a módosított analízis linearitási egyenletét a mért eredmények és a várható értékek átlagai alapján számoltuk ki.
Az LC-MS/MS analízis eljárás
A jelen vizsgálatban végzett LC-MS/MS analízis a következő. Belső standardként difenhidramint használtunk. Acetonitrilt használtunk szérumkiválasztó anyagként az albumin eltávolítására. Az LC elválasztásokhoz Hypersil ODS-BP C18 (5 μm, 2,1 × 150 mm) oszlopot használtunk. A mobilfázis 0,1%-os hangyasav és acetonitril volt. A gradiens elúciót 0,5 ml/perc áramlási sebességgel végeztük 30 °C-on. Az MTX és a difenhidramin kimutatására többszörös reakciófigyelő (MRM) üzemmódot használtunk elektrospray ionizációs (ESI) forrásban és pozitív ionszkennelési üzemmódban. Az MTX-et az m/z 455,0 → 308,1, a difenhidramint az m/z 256,0 → 167,0 m/z-nél detektáltuk.
Módszer összehasonlítása
Százkilencven mintát gyűjtöttünk akut limfoblasztos leukémiás betegektől a Dalian Gyermekkórház hematológiai osztályán. Minden mintát módosított EMIT-teszttel, illetve LC-MS/MS-teszttel vizsgáltak. Az eredményeket egyszerű lineáris regressziós elemzéssel hasonlítottuk össze (MedCalc statisztikai szoftver 15.6.1-es verziója). További 45 mintát vizsgáltunk a módosított EMIT-próbával és a kereskedelmi EMIT-próbával a módszer összehasonlítása céljából.
Interferencia vizsgálatok
A triglicerid interferenciát a minták Intralipiddel (20%-os IV zsíremulzió) történő előkészítésével vizsgáltuk. A mintákban a trigliceridek koncentrációja 1000 ng/dl volt. Ezután Páros-T tesztet végeztünk.
A bilirubin interferenciát néhány MTX-mentes ikterikus plazmamintával szimuláltuk, amelyek bilirubin koncentrációja nem volt kevesebb, mint 30 mg/dl.
A szerkezetileg rokon 7-hidroxi-metotrexát metabolit interferenciáját a plazmamintákhoz különböző mennyiségű 7-hidroxi-metotrexát hozzáadásával vizsgáltuk, az MTX koncentrációja ezekben a mintákban 0,05 μmoL/L volt. Az aktuális minták vizsgálati eredményeit pedig összehasonlítottuk az eredeti minták eredményeivel .