A hemagglutináció-gátlási próba általános célja a specifikus vírusok elleni antitest-titerek mérése. Ez a módszer segíthet megválaszolni a vakcinológia területén a vakcina által közvetített immunitással és védettséggel kapcsolatos kulcsfontosságú kérdéseket különböző populációkon belül, valamint különböző kor- és betegcsoportokban. A technika fő előnye, hogy pontos, és hogy lehetővé teszi a semlegesítő antitestek jelenlétének gyors titer-meghatározását.
Noha ez a módszer betekintést nyújt a humán antitesttiterekbe, más rendszerekre is alkalmazható, például egérszérum antitesttiterére, tenyésztési felülúszókra is. Kezdje a 96 lyukú mikrotiterlemezek felcímkézésével a megfelelő kísérleti információkkal. Ezután fordítsa a lemezt függőleges orientációba, és egy többcsatornás pipetta segítségével adjon 25 mikroliter PBS-t minden lyukba, kivéve az alsó hátsó titrálási sor első lyukát.
Adjon 50 mikroliter frissen készített, kívánt antigénoldatot a hátsó titrálási sor első lyukába, majd adjon 25 mikroliter RDE-vel kezelt szérummintát a felső tíz sor első lyukaiba. Pozitív kontrollként adjunk 25 mikroliter megfelelő antiszérumot a 11. sor első mélyedésébe. A sorozatos, kétszeres hígítások elvégzéséhez minden sor első mélyedéséből 25 mikrolitert helyezzen át az egymást követő mélyedésekbe.
Minden hígítási lépésnél 10-15 alkalommal pipettázzon fel és le, az utolsó 25 mikrolitert pedig dobja el az utolsó mélyedésekből. Ezután adjon 25 mikrolitert az antigénoldatból az elsőtől a 11. sor minden egyes mélyedésébe, és csak 25 mikrolitert PBS-t a hátsó titrálási sor minden egyes mélyedésébe. Óvatosan kopogtassa meg a lemezt 10 alkalommal mind a négy oldalon a keverés érdekében.
Ezután fedje le a lemezt 30 percre szobahőmérsékleten. Az inkubáció végén adjon 50 mikroliter vörösvérsejtoldatot minden egyes mélyedésbe, és több kopogtatással keverje össze a lemezt. Ezután ismét fedje le a lemezt, és inkubálja a vörösvértesteket a használt fajnak megfelelően a táblázatban leírtak szerint.
A vörösvértestek lemezbe történő hozzáadása után tartsa be a vizsgálatban használt vértípusnak megfelelő inkubációs időt. A túl rövid vagy túl hosszú inkubáció az eredmények helytelen értelmezéséhez vezet. Az inkubáció végén értékelje a hemagglutinációt úgy, hogy a lemezt 25 másodpercig 90 fokban megdönti, és a 96 lyukú lemez kinyomtatott sémáján jelölje meg az eredményeket minden egyes lyuk esetében, miközben a lemez még mindig meg van döntve.
A kísérletben a vakcina által kiváltott ellenanyagválaszt 26 egészséges önkéntesnél értékelték, akik a 2015. évi 24 influenzaszezon előtt influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 és B/Massachusetts/O2/2012 influenzát tartalmazó inaktivált, trivalens influenza vakcinát kaptak. Az A/H3N2/Svájc/2013 és az A/H3N2/Texas/2012 vírustörzsekre keresztreaktív immunválaszt figyeltek meg, az influenza A/H3N2/Svájc/2013 vírustörzsekkel szemben az A/H3N2/Texas/2012 influenzához képest szignifikánsan alacsonyabb hemagglutinációs gátlási titert és indukált szeroprotekciót mutattak ki. A vakcinázást követően mindkét törzzsel szemben emelkedtek az antitesttiterek, annak ellenére, hogy az A/H3N2/Svájc/2013 törzs nem volt jelen a vakcinában.
A vírus hemagglutinin fajfüggő potenciált mutat az eritrociták hemagglutinációjára. Érdekesség, hogy a tengerimalacvér nem hemagglutinál megfelelően influenza B-vel, a pulykavér pedig magas titerrel és alacsony keresztreaktivitással rendelkezik hemagglutinációs potenciállal. Ha egyszer elsajátítottuk ezt a technikát, akkor a három óra alatt elvégezhető, ha megfelelően végezzük.
Az eljárás megkísérlése során fontos, hogy ne feledkezzünk meg a vírus hemagglutinációja során a nem specifikus inhibitorok és a nem specifikus kötődések inaktiválása érdekében RDE-vel történő szérumozásról. Ezt az eljárást követően más módszereket, például ELISA-t lehet végezni az egyes kórokozóspecifikus immunglobulinok szerepére vonatkozó további kérdések megválaszolására. Kifejlesztése után ez a technika megnyitotta az utat a vírusimmunológia területén dolgozó kutatók számára, hogy jobban megértsük a vakcinával kapcsolatos immunitást egészséges és immunszupprimált betegeknél a különböző korcsoportokon belül.
A videó megtekintése után jól meg kell értenie, hogyan kell elvégezni a hemagglutináció-gátlási vizsgálatot az influenzatörzs-specifikus antitesttiterek nagymértékű számszerűsítésére. Ne feledje, hogy a vírusantigénekkel, állati vérrel és emberi szérummintákkal való munka rendkívül veszélyes lehet, és hogy az eljárás végrehajtása során mindig óvintézkedéseket kell tenni, például BSL2 laboratóriumban dolgozni.